[發(fā)明專利]線粒體功能干預(yù)材料在制備改善線粒體功能的保健品或藥品中的應(yīng)用及其篩選方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011433402.2
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112451673A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李言;王立;聶陳志鵬;賀瑞坤;張旭光
• 申請（專利權(quán)）人: 湯臣倍健股份有限公司
• 主分類號: A61K45/00
• 分類號: A61K45/00;A61K38/01;A61K31/706;A61P3/00;C12Q1/02;A23L33/13;A23L33/18;A23L33/105
• 代理公司: 廣州致信偉盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44253
• 代理人: 彭玲

1.線粒體功能干預(yù)材料在制備改善線粒體功能的保健品或藥品中的應(yīng)用，其特征在于，所述線粒體功能干預(yù)材料為NMN、海參肽、西蘭花種子水提物、枸杞提取物、槲皮素、橘皮苷或積雪草提取物中一種或幾種的混合，優(yōu)選為NMN或海參肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述改善線粒體功能是改善酰基肉堿的累積。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述改善線粒體功能是改善基礎(chǔ)耗氧量、ATP 生成或最大耗氧量。

4.一種線粒體功能干預(yù)材料的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）采用棕櫚酸構(gòu)建線粒體損傷模型；

（2）通過 LC-MS/MS法測定酰基肉堿；

（3）運(yùn)用Seahorse細(xì)胞外通量分析儀檢測呼吸功能；

（4）定量PCR檢測線粒體DNA含量；

（5）實(shí)時(shí)定量PCR檢測主要與線粒體相關(guān)基因的mRNA水平的表達(dá)；

（6）采用Western blot法檢測骨骼肌中線粒體相關(guān)基因與氧化磷酸化復(fù)合體蛋白質(zhì)；

（7）采用試劑盒檢測MDA含量及NAD+/NADH含量；

（8）采用透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種線粒體功能干預(yù)材料的篩選方法，其特征在于，所述步驟（1）采用棕櫚酸構(gòu)建線粒體損傷模型具體包括如下步驟：

a、 細(xì)胞培養(yǎng)

選用C2C12成肌細(xì)胞，放入生長培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

b、細(xì)胞傳代

待細(xì)胞融合率達(dá)到80-85%時(shí)吸出生長培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞，加入胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)

50~70%的細(xì)胞變亮變圓時(shí)，吸棄胰酶，加入生長培養(yǎng)基終止胰酶消化，脫落已消化的細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，離心，吸棄上清液，加入生長培養(yǎng)基，按特定的傳代比例傳至加有生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)；

c、細(xì)胞分化

待細(xì)胞生長融合率達(dá)到75-80%時(shí)吸出生長培養(yǎng)基，加入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化；

d、原料處理

將分化好的C2C12成肌細(xì)胞中的分化培養(yǎng)基吸干，并用PBS潤洗，然后加入棕櫚酸溶液以及原料，將加好原料的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液存放于-80℃，備用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種線粒體功能干預(yù)材料的篩選方法，其特征在于，所述生長培養(yǎng)基含有10%FBS和1% P/S；所述分化培養(yǎng)基含有2%HS和1% P/S。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種線粒體功能干預(yù)材料的篩選方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)的條件為37℃，5%CO₂。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種線粒體功能干預(yù)材料的篩選方法，其特征在于，所述棕櫚酸溶液的配置方法為：

稱取棕櫚酸溶解于無水乙醇中，得到棕櫚酸乙醇溶液；稱取BSA溶解于PBS中，得到PBS溶液；將棕櫚酸乙醇溶液加到PBS溶液中，配制成終濃度為5 mM的棕櫚酸溶液。