[發(fā)明專利]一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011432286.2
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112442504B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周紅;邱興陽;汪新艷;張安英;楊鵾
• 申請（專利權(quán)）人: 電子科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/85;C07K14/54;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11870
• 代理人: 李夢蝶

本發(fā)明公開了一種重組草魚白介素?12活性蛋白的制備方法，包括以下步驟：將p35核酸序列先構(gòu)建到載體上，再將p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，獲得能夠完整表達單鏈IL?12蛋白的質(zhì)粒；點種CHO/dhFr?細胞并轉(zhuǎn)染S3所得質(zhì)粒，然后采用MTX連續(xù)梯度加壓篩選，獲得單克隆細胞；培養(yǎng)單克隆細胞，收集細胞培養(yǎng)基，采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測分泌到培養(yǎng)基中的蛋白，篩得高表達IL?12的細胞株；對高表達IL?12的細胞株進行懸浮馴化培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)基，過濾，純化，即得。本發(fā)明利用柔性氨基酸鏈連接草魚p40和p35兩個亞基以獲得穩(wěn)定的重組草魚IL?12蛋白，便于深入研究其生物學(xué)功能及后續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

草魚是重要的經(jīng)濟魚類之一，在不斷擴大的養(yǎng)殖面積的過程中，其病害以成為阻礙草魚養(yǎng)殖發(fā)展的關(guān)鍵問題，因此解決養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的疾病是首要目的，而機體的免疫系統(tǒng)對于抵抗外界病原體等具有重要作用。

白細胞介素12(Interleukin 12,IL-12)是一種異源二聚體細胞因子，由p35和p40兩個亞基通過鏈間二硫鍵連接構(gòu)成。IL-12主要由活化的巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞產(chǎn)生；其主要功能刺激T或NK細胞分泌干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)，從而激活巨噬細胞發(fā)揮功能以及促進T輔助細胞1(T helper cell 1,Th1)的分化和增殖，表明IL-12在調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中充當(dāng)重要角色。IL-12作為可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的重要因子，可在提高機體抵抗力方面具有一定的作用；除此之外，IL-12還可以作為一種免疫佐劑提高疫苗的免疫保護效果。但目前關(guān)于魚類IL-12穩(wěn)定重組蛋白及相關(guān)功能研究較少。

現(xiàn)有技術(shù)中魚類中白細胞介素-12的重組蛋白獲得方法有將表達p40和表達p35亞基的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入昆蟲細胞中，經(jīng)表達獲得異源二聚體的白細胞介素-12重組蛋白，但p40，p35單獨轉(zhuǎn)染入細胞中，需優(yōu)化兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例，獲得的重組蛋白量少，獲得的異源二聚體形式不穩(wěn)定。

現(xiàn)有技術(shù)中還有將編碼p40與p35亞基的核酸序列串聯(lián)構(gòu)建在同一個表達質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌或昆蟲細胞后獲得穩(wěn)定的白細胞介素-12重組蛋白，p40與p35串聯(lián)形成單鏈IL-12，解決重組蛋白不穩(wěn)定因素，但使用大腸表達系統(tǒng)不能很好控制內(nèi)毒素含量，且實驗結(jié)果顯示所獲得重組蛋白活性不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法，包括以下步驟：

S1.用帶有(GGGGS)3linker核酸序列的引物擴增，獲得的帶有(GGGGS)3linker的p35核酸序列；

S2.用帶有HindIII酶切位點的引物擴增，獲得p40核酸序列；

S3.將S1所得p35核酸序列先構(gòu)建到載體上，再S2所得p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，獲得能夠完整表達單鏈IL-12蛋白的質(zhì)粒；

S4.點種CHO/dhFr-細胞并轉(zhuǎn)染S3所得質(zhì)粒，然后采用MTX連續(xù)梯度加壓篩選，獲得單克隆的細胞；

S5.培養(yǎng)S4所得單克隆細胞，收集細胞培養(yǎng)基，采用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測分泌到培養(yǎng)基中的蛋白，篩得高表達IL-12的細胞株；

S6.對S5所得高表達IL-12的細胞株進行懸浮馴化培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)基，過濾，純化，即得。