[發明專利]一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 202011432286.2
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112442504B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 周紅;邱興陽;汪新艷;張安英;楊鵾
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: C12N15/24
• 分類號: C12N15/24;C12N15/85;C07K14/54;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 李夢蝶

1.一種重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.用帶有(GGGGS)3 linker核酸序列的引物擴增，獲得的帶有(GGGGS)3 linker的p35核酸序列；所述引物序列如序列1和序列2所示；

S2.用帶有HindIII酶切位點的引物擴增，獲得p40核酸序列；所述引物序列如序列3和序列4所示；

S3.將S1所得p35核酸序列先構建到載體上，再S2所得p40核酸序列插入到(GGGGS)3linker前，獲得能夠完整表達單鏈IL-12蛋白的質粒；獲得能夠完整表達單鏈IL-12蛋白的質粒后，經過轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性單克隆，測序驗證，然后抽提質粒用于轉染；

S4.點種CHO/dhFr-細胞并轉染S3所得質粒，然后采用MTX連續梯度加壓篩選，獲得單克隆的細胞；

S5.培養S4所得單克隆細胞，收集細胞培養基，采用蛋白質免疫印跡檢測分泌到培養基中的蛋白，篩得高表達IL-12的細胞株；

S6.對S5所得高表達IL-12的細胞株進行懸浮馴化培養，收集細胞培養基，過濾，純化，即得；所述載體為pSV2-dhfr載體；所述懸浮馴化培養具體為：待細胞在原培養基中長到培養容器60-70%時，采用無血清培養基SFM4CHO進行培養，經過兩次換液，得到大量懸浮培養的細胞；然后將獲得細胞接種可換氣培養容器，培養至2×10⁶ cells/mL時，間隔一天加入補充物L-glutamine和乳化劑F68，連續添加三次之后通過離心法收集細胞培養基；

所述MTX連續梯度加壓濃度為10、30、100、250和500 nM。

2.根據權利要求1所述的重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述MTX連續梯度加壓過程中，每次加壓之后待細胞正常增殖后進行下一濃度梯度的MTX篩選。

3.根據權利要求1所述的重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法，其特征在于，所述純化具體為：采用HisTrap HP柱進行親和層析，用結合緩沖液pH 7.4 Binding buffer平衡，隨后上樣至平衡好的親和柱；上樣完畢后用不同濃度的洗脫緩沖液pH 7.4 Elutionbuffer洗脫。

4.根據權利要求3所述的重組草魚白介素-12活性蛋白的制備方法，其特征在于，采用Superdex 25柱進行分子篩層析，以pH7.4 10 mM PB洗脫收集蛋白主峰。