[發明專利]一種檢測HLA-B*15:02等位基因的熒光PCR方法及特異性引物探針組合

在審

• 申請號: 202011431450.8
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112458156A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 鐘子華;戴鵬高;王豪;蔡芝燁;孟磊;王樂
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

1.一種針對HLA-B*15:02等位基因的特異性引物探針組合，其特征在于，包括：

HLA-B*15:02等位基因特異性上游引物Fm:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAT-3’；

非HLA-B*15:02等位基因特異性上游引物Fn1:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATCAA-3’；

非HLA-B*15:02等位基因特異性上游引物Fn2:5’-CCTCATTACTGGGAAGCAGCATGAA-3’；

下游引物R:5’-CCACAACCATCAAGGCGATACATCT-3’；

探針P：5’-ROX-ACGCAGCCTGGGACCCTGTGTGCCAGCA-BHQ1-3’；

其中，ROX為熒光基團，BHQ1為淬滅基團。

2.根據權利要求1所述的特異性引物探針組合，其特征在于，還包括針對內參基因β-Actin所設計的特異性引物和探針，具體如下：

上游引物ACTB-F:5’-CTCTCTGACTAGGTGTCTAAGACA-3’；

下游引物ACTB-R:5’-GAGTCTGTTCAGACCTACTGTG-3’；

探針ACTB-P:5’-FAM-AGGTACTAACACTGGCTCGTGTGAC–BHQ1-3’；

其中，FAM為熒光基團，BHQ1為淬滅基團。

3.權利要求1或2所述特異性引物探針組合在制備基于熒光PCR反應檢測HLA-B*15:02等位基因的檢測工具的用途。

4.根據權利要求3所述的用途，所述檢測工具為試劑盒或芯片。

5.一種基于熒光PCR反應檢測HLA-B*15:02等位基因的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1或2所述的特異性引物探針組合。

6.一種檢測HLA-B*15:02等位基因的TaqMan探針實時熒光PCR方法，用于非疾病診斷目的，其特征在于，包括以下步驟：

1)獲取待測樣本基因組DNA；

2)在針對HLA-B*15:02等位基因陽性與針對HLA-B*15:02等位基因陰性反應體系中分別按配比加入所述待測樣本基因組DNA、權利要求1或2所述的特異性引物探針組合、以及PCR相關反應試劑；

3)通過熒光PCR檢測，采集ROX與FAM熒光通道的熒光信號；

4)通過熒光信號結果分析判斷待測樣本攜帶HLA-B*15:02等位基因的情況。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR相關反應試劑包括dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR反應緩沖液和用于補充體系的雙蒸水。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，以反應體系為20μL計，則包括：

管1:：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fm0.4μL、下游引物R 0.4μL、探針P 0.2μL、內參上游引物0.2μL、內參下游引物0.2μL、內參探針0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待測樣本基因組DNA 2μL，用雙蒸水將體積補足至20μL；

管2：5xbuffer 4μL、10xbuffer 2μL、dNTP 2μL、上游引物Fn1 0.2μL、上游引物Fn2 0.2μL下游引物R 0.4μL、探針P 0.2μL、內參上游引物0.2μL、內參下游引物0.2μL、內參探針0.1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、待測樣本基因組DNA 2μL，用雙蒸水將體積補足至20μL；

其中，5xbuffer、10xbuffer、Taq DNA聚合酶來自菲鵬生物股份有限公司的產品Hotstart HiTaq DNA Polymerase。