[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)基因突變與拷貝數(shù)變化的高通量方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011430980.0
• 申請(qǐng)日: 2020-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112522381A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊鋒;余偉師;梁萌萌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州賽美科基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 南京九致知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32307
• 代理人: 韓蓮

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)基因突變與拷貝數(shù)變化的高通量方法，包括：針對(duì)多個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域，分別設(shè)計(jì)一對(duì)正鏈探針和負(fù)鏈探針；使用所述正鏈探針和所述負(fù)鏈探針進(jìn)行組合得到組合探針，并基于組合探針對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，利用一對(duì)與二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序引物相匹配的PCR引物對(duì)第一輪PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；對(duì)第二輪PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行高通量雙端測(cè)序；對(duì)高通量雙端測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行目標(biāo)位點(diǎn)基因型判定及拷貝數(shù)分析。解決了現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法做到基因區(qū)域點(diǎn)突變及拷貝數(shù)變異在一種技術(shù)中同時(shí)檢測(cè)的問(wèn)題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)基因突變與拷貝數(shù)變化的高通量方法。

背景技術(shù)

基因是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列。除了部分病毒遺傳物質(zhì)是RNA外，幾乎所有非病毒生物的遺傳物質(zhì)是DNA。不同物種都有其特異的基因序列，因此通過(guò)檢測(cè)樣品中的基因序列可以判斷樣品中存在的生物種性。細(xì)胞在生命過(guò)程中，基因通過(guò)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后細(xì)胞以mRNA為模板翻譯出有生物活性的蛋白質(zhì)分子，從而將貯存在DNA序列中遺傳信息表現(xiàn)出來(lái)?；蛞环矫婺苣苤覍?shí)地復(fù)制自己，以保持生物的基本特征；另一方面基因在復(fù)制過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)產(chǎn)生“突變”。這種突變包括點(diǎn)突變、大片段缺失/重復(fù)(稱為拷貝數(shù)多態(tài)，CNV)、基因倒位或基因易位等。有的突變會(huì)嚴(yán)重影響關(guān)鍵基因的功能從而導(dǎo)致疾病，由于受到選擇作用，這類突變?cè)谌后w中的頻率非常低，而相當(dāng)一部分突變由于并未嚴(yán)重影響基因功能或影響的基因并不對(duì)個(gè)體造成生存壓力，他們?cè)谌后w中會(huì)保留下來(lái)并由于受到隨機(jī)漂變以及奠基者效應(yīng)發(fā)生頻率的改變，從而成為群體中的一種遺傳多態(tài)，對(duì)于單堿基或寡堿基改變的多態(tài)被稱之為單核苷酸多態(tài)(SNP)，而對(duì)于大區(qū)段的缺失或重復(fù)多態(tài)被稱之為拷貝數(shù)多態(tài)(CNP)。

遺傳多態(tài)以及基因突變分析是研究基因功能以及遺傳性疾病的致病機(jī)理最常見(jiàn)的遺傳分析方法。因此，基因鑒定、基因表達(dá)分析、DNA甲基化分析、突變篩查、SNP分型、CNP分型以及CNV檢測(cè)是重要的分子遺傳學(xué)研究手段，而且在臨床分子診斷上也有著廣泛的應(yīng)用(Varela MA et al,2010)。正因?yàn)檫@些遺傳分析的重要性，對(duì)于每一種分析，科學(xué)家及工程師們都開(kāi)發(fā)出了多種檢測(cè)方法。

但申請(qǐng)人在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)的手段仍然存在如下技術(shù)問(wèn)題：早期的檢測(cè)方法主要針對(duì)有限的目的片段分析。用于SNP檢測(cè)的方法如TaqMan探針等位基因檢測(cè)技術(shù)、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)(RFLP)、高分辨率融解曲線反應(yīng)、單堿基延伸技術(shù)等。中小通量CNV的檢測(cè)方法主要包括實(shí)時(shí)定量PCR、FISH、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)等。上述方法靈活性很高，但最大的缺陷是通量太低，往往需要結(jié)合不同技術(shù)對(duì)基因區(qū)域位點(diǎn)及拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于需要檢測(cè)大量基因位點(diǎn)的研究項(xiàng)目或診斷需求時(shí)就顯得無(wú)能為力了。

微陣列芯片(Microarray)以高密度探針陣列為特征，利用分子雜交原理,將各種處理過(guò)的熒光標(biāo)記樣本與微陣列探針進(jìn)行雜交，然后經(jīng)過(guò)洗滌去除非特異雜交信號(hào)，最后用掃描儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱以及熒光信號(hào)所在的陣列位置確認(rèn)目的基因相關(guān)的信號(hào)量(Maskos U et al,1992)。微陣列芯片最大的優(yōu)勢(shì)就是高通量，能夠在整個(gè)基因組水平上分析基因的變化，但其缺陷是由于普遍存在非特異性雜交，定量的準(zhǔn)確性較差，同時(shí)需要昂貴的雜交及掃描儀器，成本高而且定制芯片時(shí)間長(zhǎng)費(fèi)用高，對(duì)未知基因無(wú)法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

下一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)給基因檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)個(gè)革命性的變化。定制合成混合寡核苷酸(探針)在液相中對(duì)剪切的基因組DNA樣本進(jìn)行雜交捕獲是一種可以捕獲較大區(qū)域的方法。高通量測(cè)序技術(shù)的最大的優(yōu)勢(shì)就是通量很大。這種富集技術(shù)主要用于候選基因的突變檢測(cè)，但由于這些富集過(guò)程在一定程度上消除了產(chǎn)物與原始模板量的正比關(guān)系，因此不能準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)富集的候選基因片段進(jìn)行定量分析，如表達(dá)量以及拷貝數(shù)分析。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)實(shí)施例通過(guò)提供一種同時(shí)檢測(cè)基因突變與拷貝數(shù)變化的高通量方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法做到基因區(qū)域點(diǎn)突變及拷貝數(shù)變異在一種技術(shù)中同時(shí)檢測(cè)的問(wèn)題。