[發(fā)明專利]一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011424552.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN112522168A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭璞;陳春梅;陳鵬程;吳丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12N15/60;C12N15/31;C12P7/46;C12R1/01
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明通過在產(chǎn)琥珀酸放線菌中過表達(dá)谷氨酸脫羧酶和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸生成γ?氨基丁酸，再通過氨基轉(zhuǎn)運(yùn)載體把γ?氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，在此過程中消耗一個(gè)質(zhì)子，中和酸的壓力，提高產(chǎn)琥珀酸放線菌的耐酸能力，從而降低發(fā)酵過程pH調(diào)節(jié)劑用量和副產(chǎn)物乙酸的生成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

琥珀酸(又名丁二酸)是一種C4平臺(tái)化學(xué)品，是一種天然有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物、人與微生物中。它能廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、化工行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中。近些年來，由于琥珀酸可以作為C4平臺(tái)化合物用于合成大量化學(xué)品和生物可降解塑料，且其被美國(guó)能源部列為12種有潛質(zhì)的化學(xué)品之一。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌是一株從牛的瘤胃中分離的高產(chǎn)琥珀酸的革蘭氏陰性菌，它能天然的生產(chǎn)琥珀酸，且能利用廣譜的碳源用于生產(chǎn)琥珀酸，是生產(chǎn)琥珀酸最有潛力的微生物之一。密西根大學(xué)篩選的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌ATCC 55618最適生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的pH為6.8(US5573931，US 5521075，US 5504004等)；南京工業(yè)大學(xué)姜岷等篩選的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CGMCC NO.1716的pH生長(zhǎng)范圍為5.0-8.0，最適產(chǎn)酸pH 7.0(ZL 201610382379.6，ZL201410212929.0，ZL 200610085415.9等)；本實(shí)驗(yàn)室篩選的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CGMCC1593的pH維持6.2-7.1，可滿足生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的需求(ZL 200810146688.9，ZL 201210056568.6，ZL201110209999.7等)。

雖然利用產(chǎn)琥珀酸放線桿菌成功地實(shí)現(xiàn)了琥珀酸的高產(chǎn)率，但在其發(fā)酵過程中，隨著琥珀酸與其他副產(chǎn)物酸的不斷累積，使培養(yǎng)基的pH不斷降低，而產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的耐酸能力較弱，在酸性條件下易死亡，且大多數(shù)發(fā)酵都是在中性條件下進(jìn)行的，因此需要大量的堿來維持中性pH條件，同時(shí)存在細(xì)菌污染的可能性。此外，在下游的工業(yè)處理步驟中，必須消耗大約等量的酸來將琥珀酸重新酸化為琥珀酸，這不僅會(huì)增加整個(gè)過程的成本，而且由于排放了大量以離子為主的廢水，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成破壞。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌，通過在產(chǎn)琥珀酸放線菌中過表達(dá)谷氨酸脫羧酶(GadB)/刪除C末端11個(gè)氨基酸的GadB(GadB_△C11)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(GadC)，通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸，再通過氨基轉(zhuǎn)運(yùn)載體把γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，在此過程中消耗一個(gè)質(zhì)子，中和酸的壓力，提高產(chǎn)琥珀酸放線菌的耐酸能力，從而降低發(fā)酵過程pH調(diào)節(jié)劑用量。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌，所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌是在產(chǎn)琥珀酸放線桿菌中過表達(dá)谷氨酸脫羧酶GadB和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體GadC。

進(jìn)一步地，所述的谷氨酸脫羧酶GadB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，所述的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體GadC的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步地，所述的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌基因工程菌中，所述的谷氨酸脫羧酶GadB還包括刪除C末端的11個(gè)氨基酸的谷氨酸脫羧酶GadB。

進(jìn)一步地，編碼所述的谷氨酸脫羧酶GadB的基因或編碼刪除C末端的11個(gè)氨基酸的谷氨酸脫羧酶GadB的基因，與編碼所述的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體GadC的基因之間還包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBS片段。

進(jìn)一步地，編碼所述的谷氨酸脫羧酶GadB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，編碼所述的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體GadC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。