[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物及基于該引物的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011424383.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN112481390A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊立桃;徐文婷;張大兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海段和段律師事務(wù)所 31334
• 代理人: 李佳俊;郭國(guó)中

本發(fā)明屬于生物學(xué),涉及轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)領(lǐng)域,公開了一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物及基于該引物的檢測(cè)方法。所述引物包括正向引物GM?LYZ?5?F和反向引物GM?LYZ?5?R，所述正向引物GM?LYZ?5?F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物GM?LYZ?5?R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明相比傳統(tǒng)的qPCR技術(shù)具有靈敏度高,特異性強(qiáng),精確度好,以及不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì),特別在對(duì)低拷貝數(shù)和痕量樣本具有重要意義；本方法對(duì)于轉(zhuǎn)基因羊的常規(guī)監(jiān)管和檢測(cè)提供技術(shù)依據(jù),對(duì)于科研單位和高校的轉(zhuǎn)基因羊研究同樣適用,有廣泛的潛在應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種數(shù)字PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性的引物、探針和方法，尤其涉及一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物及基于該引物的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用基因重組,轉(zhuǎn)化等技術(shù)將人工分離和修飾過的DNA將特定的外源基因整合到生物體基因組當(dāng)中,使其產(chǎn)生定向的遺傳改變,并能夠穩(wěn)定遺傳給下一代。伴隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷地發(fā)展和生物生產(chǎn)的需求,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究已經(jīng)進(jìn)入成熟的產(chǎn)業(yè)化階段,相繼獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠、豬、山羊、牛等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物日益增多的同時(shí),相應(yīng)安全性問題引發(fā)國(guó)際社會(huì)及相關(guān)監(jiān)管部門的重視。

我國(guó)政府高度重視轉(zhuǎn)基因生物安全的管理,已經(jīng)頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》等系列法規(guī),約束和限制轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)和標(biāo)識(shí)。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的監(jiān)管已經(jīng)非常完備,對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性評(píng)價(jià)研究主要集中在動(dòng)物自身生長(zhǎng)繁殖健康問題等方面,對(duì)環(huán)境安全評(píng)價(jià)卻寥寥無幾。

2006年3月19日,國(guó)家專利局批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因溶菌酶奶羊?qū)＠Ｗ鳛槿榉磻?yīng)發(fā)生器,這種奶羊能夠產(chǎn)出含有高濃度溶菌酶的羊奶。溶菌酶是天然的蛋白質(zhì),能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的糖苷鍵,具有溶菌作用。常用于殺菌,防腐,乳品添加劑,治療炎癥和腫瘤等領(lǐng)域。目前，尚未任何關(guān)于對(duì)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系檢測(cè)的方法。為了有效實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊的品系特異性序列并對(duì)引物、探針及擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性的微滴數(shù)字PCR(droplet digitalPCR)檢測(cè)方法，并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因羊及其制品檢測(cè)，如羊奶、羊奶制品、羊糞便等。

微滴數(shù)字PCR技術(shù)的原理是將樣本DNA無限稀釋到上千或者上萬份，被分配到不同的單元里,每個(gè)單元最多含有1個(gè)DNA分子，形成油包水液滴。每個(gè)反應(yīng)單元經(jīng)過獨(dú)立PCR擴(kuò)增,反應(yīng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)每個(gè)單元的熒光信號(hào)，根據(jù)泊松分布和陽性微滴比例來實(shí)現(xiàn)核酸分子的絕對(duì)定量，計(jì)算原始樣本中靶基因的拷貝數(shù)。數(shù)字PCR技術(shù)相比較于傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術(shù)和常規(guī)PCR方法相比，存在明顯的優(yōu)勢(shì):絕對(duì)定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本需求量低，可檢測(cè)低濃度樣本；靈敏度高，可檢測(cè)出低拷貝痕量樣本以及精確分析極小目的片段差異；高度耐受抑制劑,能夠降低反應(yīng)體系中的噪音和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾等。在對(duì)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系的監(jiān)管中，主要的監(jiān)管對(duì)象是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本身和其生產(chǎn)的產(chǎn)品，如羊奶、羊奶制品等，針對(duì)這些制品的檢測(cè)，目前的熒光定量PCR技術(shù)存在靈敏度低、依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等缺點(diǎn)。

因此,本發(fā)明提供了一種基于微滴數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)于轉(zhuǎn)基因羊及其制品的檢測(cè)，擺脫標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物及基于該引物的檢測(cè)方法，能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物，包括正向引物GM-LYZ-5-F和反向引物GM-LYZ-5-R，所述正向引物GM-LYZ-5-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物GM-LYZ-5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。