[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物及基于該引物的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011424383.7
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112481390A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊立桃;徐文婷;張大兵
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 上海段和段律師事務(wù)所 31334
• 代理人: 李佳俊;郭國中

1.一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR引物，其特征在于，包括正向引物GM-LYZ-5-F和反向引物GM-LYZ-5-R，所述正向引物GM-LYZ-5-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述反向引物GM-LYZ-5-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測的PCR反應(yīng)體系，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR的PCR反應(yīng)體系，其特征在于，所述檢測系統(tǒng)還包括探針GM-LYZ-5-P，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述探針的5’端包含有熒光報告基團(tuán)，3’端包含有熒光淬滅基團(tuán)。

4.一種基于權(quán)利要求2或3所述反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、配制PCR反應(yīng)體系：每20ul反應(yīng)體系中，包括：10μl數(shù)字PCR預(yù)混液,1μl正向引物GM-LYZ-5-F,1μl反向引物GM-LYZ-5-R,0.5μl探針GM-LYZ-5-P,5.5μl H₂0,2μl待檢測轉(zhuǎn)基因羊的DNA稀釋液；

B、通過微滴生成器生成油包水微滴后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下：step1:95℃5min；step2:95℃30sec,58℃1min,go to step 2,39X；98℃10min；Ramp 2.5℃/s；4℃1min,Ramp2.5℃/s；

C、擴(kuò)增結(jié)束后識別含擴(kuò)增產(chǎn)物的微滴的熒光信號并得出計(jì)數(shù)結(jié)果。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，步驟A的反應(yīng)體系中，所述正向引物、反向引物的濃度為10ng/ul，引物探針比為1:0.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，所述待檢測轉(zhuǎn)基因羊的DNA稀釋液的濃度為10-20ng/ul。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，所述待檢測轉(zhuǎn)基因羊的DNA稀釋液的樣本來源為血液樣本、細(xì)胞樣本、組織樣本、環(huán)境樣本中的任一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，步驟B中，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為80-180bp。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性微滴式數(shù)字PCR檢測方法，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為90-110bp。