[發明專利]一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的探針及其組合探針、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011424014.8
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112375837A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 黃震;王蘭
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6837;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 何凡

本發明公開了一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的探針及其組合探針、試劑盒和檢測方法。探針為如SEQ ID NO.1～20中所示的任一核苷酸序列；或對如SEQ ID NO.1～20中所示的任一核苷酸序列的骨架進行修飾后的序列，修飾位點為序列中A、C、G和T的至少一種；還提供了一種直接RNA液相芯片檢測方法，該方法能夠利用液相芯片平臺對氨氧化細菌進行mRNA直接檢測，無需經過反轉錄，以及PCR和循環剪切等擴增步驟。本發明提供的探針為氨氧化細菌重要功能基因amoA的mRNA探針，可直接表征氨氧化細菌的脫氮活性，此基因僅氨氧化細菌具有，該組探針比現有16SrRNA分子探針的特異性更強。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的探針及其組合探針、試劑盒和檢測方法。

背景技術

全國實施“控源減污”和嚴格推進環境執法后，水體有機污染得到有效遏制，氮磷污染凸顯為水體污染的主要問題。在大部分國家標準中，比如《城鎮污水處理廠污染物排放標準》，均對氨氮和總氮進行了嚴格控制；而在許多地方標準中，比如我省的《四川省岷江、沱江流域水污染物排放標準》還制定了更嚴苛的氨氮和總氮排放標準。可見，氨氮污染已成為水體污染的主要問題之一，水體氨氮污染的監測和治理迫在眉睫。

目前，生物脫氮技術是水體氮素污染治理的主要技術，對于所有的生物脫氮技術而言，以氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)為主要功能菌群的氨氧化過程是氨氮去除的必經步驟，同時也是限速步驟。因此探明水體中及污水處理體系中氨氧化細菌的豐度和活性至關重要，可為預測環境水體自凈能力、診斷污水處理工藝的脫氮效能和故障排除提供理論依據和技術支撐。

目前，主要采用以下幾種方法進行水體中氨氧化細菌豐度和活性檢測：(1)批次活性檢測法等生理活性檢測法；(2)宏基因組、宏轉錄組和高通量測序等測序檢測法；(3)RT-PCR(real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction)等PCR擴增檢測法；(4)熒光原位雜交等探針檢測方法。鮮有核酸芯片檢測方法用于氨氧化細菌豐度和活性的檢測。批次活性檢測法可直觀地體現氨氧化細菌的氨氧化活性，但其耗時長，需要測試人員連續測試一周左右，甚至需要一天24h進行觀測取樣，耗時耗力，不適宜污水處理廠效能診斷等快速檢測(WANG L,ZHENG P,XING Y,et al.Effect of particle size on theperformance of autotrophic nitrogen removal in the granular sludge bedreactor and microbiological mechanisms[J].Bioresour Technol,2014,157(0):240-6.)。隨著測序成本的降低，測序技術被廣泛應用于環境樣品DNA(宏基因組)、RNA(宏轉錄組)以及轉錄子的高通量測序，但是該測序手段需要大型測序儀進行測序，測序周期往往在1個月以上，加之宏基因組和宏轉錄組動輒10Gbases以上的數據量以及復雜專業的數據分析流程讓人望而卻步，不適宜環境微生物的快速、簡單(LAWSON C E,WU S,BHATTACHARJEEA S,et al.Metabolic network analysis reveals microbial community interactionsin anammox granules[J].Nat Commun,2017,8:1-12.)。而qPCR技術和熒光原位雜交方法通量較小，難以同時檢測多個樣品的不同菌群(WANG C,GONG B,BUSHEL P R,et al.Theconcordance between RNA-seq and microarray data depends on chemical treatmentand transcript abundance[J].Nat biotechnol,2014,32(9):926-32.)。同時，正如新冠病毒檢測中所暴露的問題所示，qPCR技術還要面臨擴增帶來的不均等放大、突變以及RNA碎片化引起的假陰性風險(PAN Y,LONG L,ZHANG D,et al.Potential False-NegativeNucleic Acid Testing Results for Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2from Thermal Inactivation of Samples with Low Viral Loads[J].Clinical chemistry,2020,66(6):794-801.)。因此亟需經濟、快速、簡便和高通量的檢測方法用于污水處理過程中氮代謝微生物的活性檢測。