[發明專利]一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的探針及其組合探針、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011424014.8
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112375837A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 黃震;王蘭
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6837;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京正華智誠專利代理事務所(普通合伙) 11870
• 代理人: 何凡

1.一種用于氨氧化細菌檢測的探針，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1～20中所示的任一核苷酸序列；或

對如SEQ ID NO.1～20中所示的任一核苷酸序列的骨架進行修飾后的序列，所述修飾位點為序列中A、C、G和T的至少一種。

2.根據權利要求1所述的用于氨氧化細菌分類檢測的探針，其特征在于，所述修飾的方式為鎖核酸修飾，對被修飾序列進行至少一個堿基修飾。

3.根據權利要求2所述的用于氨氧化細菌分類檢測的探針，其特征在于，修飾后的探針的具體序列如下：

AOB-all：5'-CCA+G+T+TRCCHGGRTAGAA-3'；

AOB-C0-P1：5'-G+A+A+CATSAGCATGGADAY-3'；

AOB-C0-P2：5'-GWAGAAVGCGGTGC+A+G+TA-3'；

AOB-C1-P1：5'-CC+A+A+ADATHGGCCAGTTRCC-3'

AOB-C1-P2：5'-C+A+T+ACRCAGWACATCARCAT-3'

AOB-C2-P1：5'-GC+A+A+TYACCGTRGTRTGRCC-3'；

AOB-C2-P2：5'-AAG+A+A+YGCHGCAATYACCGT-3'；

AOB-C3-P1：5'-CCAGTTGCCVGGRTAG+A+A+CA-3'；

AOB-C3-P2：5'-+T+T+GCCRAARTACCACCAKAC-3'；

AOB-C4-P1：5'-CC+A+A+ADATHGGCCAGTTRC-3'；

AOB-C4-P2：5'-TTRCCWARGTACCACC+A+T+AC-3'；

AOB-C5-P1：5'-+A+A+CATCARCATBGAWACRAA-3'；

AOB-C5-P2：5'-A+A+G+AAYGCHGCAATHACBGT-3'；

AOB-C6-P1：5'-CCAGTTRCCMGGRTAG+A+A+CA-3'；

AOB-C6-P2：5'-GTGGTGTGDCCGCC+A+A+AGGT-3'；

AOB-C7-P1：5'-G+T+R+TGRCCACCRAAGGTACG-3'；

AOB-C7-P2：5'-A+A+G+AAYGCRGCAATYACCGT-3'；

AOB-C8-P1：5'-CCCATGTA+R+T+DGCCATYGA-3'；

AOB-C9-P1：5'-CCCATR+T+A+GTCWGCCATYGA-3'；

AOB-C9-P2：5'-CGDCCTCTYTTACCTT+T+A+AC-3'；

堿基前的+號表示修飾位點。

4.根據權利要求1或3所述的用于氨氧化細菌分類檢測的探針，其特征在于，所述探針序列上均偶聯有微球，所述微球具有磁性或不具有磁性。

5.根據權利要求4所述的用于氨氧化細菌分類檢測的探針，其特征在于，所述微球為C₆-NH-CO-微球，所述微球中的C₆端與探針5’端的堿基連接。

6.一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的組合探針，其特征在于，包括權利要求1或3中的至少兩條探針序列。

7.一種用于對氨氧化細菌進行分類檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或3中的至少一條探針序列，或權利要求6中的組合探針。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括陽性標準品，所述陽性標準品是以待檢測樣品的mRNA片段為依據而合成的RNA序列，它與探針序列互補，其長度為30～50bp。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的工作濃度均為0.5～2mM，所述陽性標準品的濃度為500fM，工作濃度為0.1aM-500fM。

10.一種對氨氧化細菌進行分類檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品總RNA，并對其進行生物素標記，備用；

(2)采用權利要求1～5所述探針或權利要求6所述組合探針與具有生物素標記的總RNA雜交，然后加入鏈霉親和素-R-藻紅蛋白，室溫孵育5～10min，再采用液相芯片平臺對其進行檢測即可。