[發明專利]一種基于差分阻抗顆粒計數的免疫分析方法

有效

• 申請號: 202011422402.2
• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN112698024B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 陳翊平;周陽;王知龍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/546;G01N15/10;G01N15/02
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種基于差分阻抗顆粒計數的免疫分析方法，包括以下步驟：1)以高分子絕緣微球為信號探針，將生物識別分子與絕緣微球偶聯，然后將待測目標物與生物識別分子進行免疫反應，使絕緣微球的粒徑和數量發生變化；2)將反應液注入顆粒計數通道，同時向通道內高速注入緩沖液，基于流體力學原理形成層流，使反應液中的絕緣微球穩定有序地通過計數通道；3)在顆粒計數通道的兩端設置正、負電極，收集電勢信號，經放大、濾波處理后對絕緣微球的粒徑和數量進行分析，進而得到待測目標物的含量。本發明具有檢測成本低、操作便利，不會造成通道堵塞，無需反復清洗排堵等優點，極大地提高了檢測效率，而且還具有較好的準確性和抗干擾能力。

技術領域

本發明屬于食品安全、體外診斷、環境監測領域，涉及免疫分析方法，尤其是一種基于差分阻抗顆粒計數的免疫分析方法。

背景技術

食品安全、體外診斷和環境監測與民生安全和生活水平息息相關，因此改善食品安全、體外診斷和環境檢測等領域的檢測方法與手段，具有極其重要的現實意義。傳統的食品安全、體外診斷和環境監測所用儀器具有精度高、準確性好等特點，但是絕大部分儀器設備造價昂貴且攜帶不便，在進行檢測之前需要對樣本進行復雜的前處理，對使用儀器設備的人員也需要經過專業培訓。因此，傳統的儀器檢測方法，存在成本高、效率低、便攜性差等特點，制約了其進一步的發展。

免疫學分析方法在食品安全和體外診斷領域已得到廣泛應用。其中，傳統的酶聯免疫吸附法(ELISA)具有精度高、操作簡單和成本低等優點，使用酶標儀即可直接完成檢測讀數。但整個實驗操作繁瑣且耗時長，實驗過程中諸多因素均會對檢測結果產生影響。為解決上述問題，使快檢方法更加“快、穩、準”，均相免疫反應應運而生。該方法比傳統ELISA方法步驟少、操作簡單且成本低，只需要通過一步反應，即可得出檢測結果。

前期的工作中，我們將小孔電阻顆粒計數和免疫分析技術相結合，采用高分子絕緣微球作為信號探針，實現了高靈敏度與準確檢測。庫爾特電阻法在顆粒計數的儀器設備中應用眾多，實現形式多為微通道和微孔，工作原理為在通道兩段施加一定數值的恒壓電源，微電極設置在微孔兩側，當顆粒通過微孔時由于微電極間電阻變化而引起電勢變化，通過對微電極電勢變化的信號進行收集、放大、分離等處理，從而分析出待測顆粒的數量與粒徑。該方法穩定性好、顆粒識別效率高，但是基于庫爾特計數法的顆粒計數儀器造價昂貴且攜帶不便，使用過程中需要反復清洗消除背景干擾，當顆粒數過多或顆粒粒徑大于微孔孔徑時，會發生堵塞且不易清洗排堵，極大的干擾了檢測結果和降低了檢測效率。

本發明選用差分阻抗法作為顆粒計數方法，在計數通道上摒棄了易堵塞且難以清洗的微孔而選用了通道計數。基于流體動力學原理，高流速的PBS緩沖液與低流速的待檢測顆粒液體在顆粒計數通道內形成穩定的層流，待計數顆粒勻速穩定的依次通過芯片內部的金電極，實現信號收集。與之前工作相比，本發明可結合免疫反應與差分阻抗法顆粒計數技術，將傳統易堵塞的小孔計數改進為基于流體動力學原理的差分阻抗通道計數法，與傳統的基于庫爾特電阻法顆粒計數器相比，用更寬的顆粒計數通道代替小孔實現不堵塞，免去了反復清洗等繁瑣過程，提高了檢測效率和準確性，芯片制造成本低廉，可以實現一次性使用，隨用隨換，根據實際需求可以應用于多種場景的快速檢測，如食品安全快速檢測、體外診斷、環境監測等。

發明內容

本發明根據實際需求和現有設備存在的缺陷，提供了一種基于差分阻抗顆粒計數的免疫分析方法，該方法不僅可以在微流控芯片內部完成免疫反應，還可實現無堵塞、免清洗的顆粒計數與粒徑分析，從而能更好地用于多種目標物的免疫檢測。

本發明采用的技術方案是：

一種基于差分阻抗顆粒計數的免疫分析方法，包括以下步驟：

1)以高分子絕緣微球為信號探針，將生物識別分子與高分子絕緣微球偶聯，然后將待測目標物與其對應的生物識別分子進行免疫反應，使高分子絕緣微球的粒徑和數量發生變化；