[發明專利]一種參與抗旱的蘋果自噬相關基因及其應用

在審

• 申請號: 202011418438.3
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112626077A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 馬鋒旺;賈昕;龔小慶;毛柯;李超;劉長海;孫遜;霍柳青
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及基因工程技術領域，具體公開了一種參與抗旱的蘋果自噬相關基因及其應用，所述基因為MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以通過蘋果自噬抗旱基因構建強抗旱的轉基因植株，從而提高植株抗旱性。本發明的蘋果自噬抗旱基因MdATG5a，能夠用于構建強抗旱的轉基因植株，提高轉基因植物的自噬活性。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種參與抗旱的蘋果自噬相關基因及其應用。

背景技術

自噬是指當細胞處于逆境或特殊生長發育階段時，細胞降解老化受損蛋白或細胞器并將降解產物回收利用的過程，其在真核生物的進化中高度保守。植物細胞自噬主要有三種類型，包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬(Bassham,2009)。其中巨自噬是通常意義上所指的細胞自噬，也是研究最廣泛且最為深入的自噬類型。胞質成分或細胞器等待降解物被包裹進入雙層膜結構形成自噬體，雙層膜自噬體的形成是自噬過程發生的顯著標志。形成自噬體的外膜能夠與液泡膜或溶酶體膜融合，進而包裹貨物的內膜結構被運送至液泡或溶酶體的酸性環境中進行降解，其降解產物可釋放至胞質并循環利用(Liu andBassham,2012)。

自噬概念于1963年被首次提出，而后Ohsumi等于1993年在酵母中分離出了第一批自噬相關基因(Tsukada and Ohsumi,1993)。截至目前，研究人員已于酵母中鑒定出三十多個自噬相關基因。通過同源克隆的方式，動植物中的自噬相關基因相繼被克隆鑒定出來。這些自噬基因參與到自噬發生過程的每一個階段，包括自噬的誘導、自噬泡的成核與延伸擴張、自噬泡的成熟以及其與溶酶體或液泡融合等過程(Klionsky et al.,2003；Nakatogawaet al.,2009；Feng et al.,2014)。根據參與自噬發生階段的不同，可將自噬蛋白分成以下四類：ATG1激酶復合體、ATG2/9/18跨膜復合體、磷脂酰肌醇3-激酶復合體以及ATG8-PE和ATG5-12-16兩個類泛素蛋白結合系統。其中，ATG8-PE和ATG5-12-16蛋白復合體在自噬體膜的延伸擴張以及最終包裹待降解物形成自噬體的過程中發揮著重要作用。自噬蛋白ATG5所參與的ATG5-12-16類泛素結合系統作用于自噬體膜的彎曲并募集自噬蛋白ATG8，促進ATG8與PE的結合。因此，ATG5是自噬發生過程中最為關鍵的蛋白之一，擬南芥自噬缺陷突變體atg5-1無法形成自噬小體，且對多種逆境脅迫高度敏感(Le Bars et al.,2014)。

隨著自噬研究的深入，檢測自噬發生水平的方法也趨于成熟，主要手段包括以下三種：透射電鏡檢測法(TEM)、自噬體膜標志性蛋白質ATG8檢測法和單丹(磺)酰戊二胺染色法(MDC)染色法。上世紀九十年代，自噬最初被檢測到所用的方法就是TEM方法。透射電鏡檢測自噬體不僅能夠清晰觀察到自噬體的形態，還可通過所觀測到自噬體的大小與數量推測自噬活性強弱。ATG8是自噬體膜標志蛋白，其與PE共價結合由水溶形式轉變為脂溶形式，脂溶性的ATG8結合于自噬體膜上直至自噬體降解，因此ATG8常被作為指示自噬發生強度的衡量標準(Tanida et al.,2004)。MDC是自噬囊泡示蹤劑，能夠與自噬體結合，經MDC染色后可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到含有自噬泡的細胞(盧建美等，2012)。便捷成熟的自噬體檢測方法為我們的研究奠定了基礎。