[發(fā)明專利]一種參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011418438.3
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112626077A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 馬鋒旺;賈昕;龔小慶;毛柯;李超;劉長海;孫遜;霍柳青
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/74
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因，其特征在于，所述基因為MdATG5a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如權(quán)利要求1所述的參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因在構(gòu)建強抗旱的轉(zhuǎn)基因植株中的應用。

4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述植株為蘋果植株。

5.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因構(gòu)建強抗旱的轉(zhuǎn)基因植株的方法包括以下步驟：

S1，蘋果自噬相關(guān)基因的克隆；

S2，植物表達載體的構(gòu)建

通過XbaI和KpnI兩個酶切位點將MdATG5a基因的編碼區(qū)連接至pCambia2300載體上；

S3，農(nóng)桿菌介導的蘋果轉(zhuǎn)化

S3.1，將構(gòu)建成功的植物過表達載體轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌菌株，選擇PCR檢測為陽性的農(nóng)桿菌，備用；

S3.2，將S3.1中獲得的PCR檢測為陽性的農(nóng)桿菌重懸活化，并稀釋OD₆₀₀至0.5-0.6，獲得農(nóng)桿菌重懸液；

S3.3，取正常生長28-30天的蘋果組培苗的葉片，置于農(nóng)桿菌重懸液中劃傷，浸潤8-12分鐘，然后置于無菌濾紙上吸干菌液，將葉片于共培養(yǎng)培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)3天；

S3.4，沖洗葉片，吸干水分轉(zhuǎn)入延遲培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，將葉片轉(zhuǎn)移至卡那霉素篩選培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3-4周，待出現(xiàn)抗性芽后見光培養(yǎng)，30-40天后移入含有卡那霉素的繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選培養(yǎng)3-4個月；

S4，MdATG5a基因過量表達轉(zhuǎn)基因植株的鑒定，

對S3經(jīng)卡那霉素篩選后的植株，對其抗性芽取樣，在DNA與RNA水平對其進行鑒定。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建強抗旱的轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于，S1中，所述蘋果自噬相關(guān)基因的克隆具體過程為：以擬南芥AtATG5蛋白序列為依據(jù)，與薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫的蘋果基因組數(shù)據(jù)進行查找比對，找到與其同源性最高的一條基因序列，編號為MD15G1436000，根據(jù)預測序列設計引物，以‘金冠’cDNA為模板克隆得到了一條蘋果ATG5序列，命名為MdATG5a，GenBank登錄號為KY305671.1。

7.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建強抗旱的轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于，S1中，所述蘋果組培苗為″嘎啦-3”品種組培苗。

8.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，S3中，農(nóng)桿菌介導的蘋果轉(zhuǎn)化過程中所用各培養(yǎng)基配方分別為：

農(nóng)桿菌重懸液培養(yǎng)基：0.443％MS粉+2％蔗糖+20mM檸檬酸鈉+0.1mM乙酰丁香酮+1mM甜菜堿，pH 5.3；

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％瓊脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA；

延遲篩選培養(yǎng)基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％瓊脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/L頭孢；

篩選培養(yǎng)基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％瓊脂+2.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+250mg/LCef+25mg/L卡那霉素；

繼代篩選培養(yǎng)基：0.443％MS粉+3％蔗糖+0.8％瓊脂+0.3mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA+25mg/L卡那霉素。

9.如權(quán)利要求1所述的參與抗旱的蘋果自噬相關(guān)基因在提高植物自噬活性上的應用。