[發(fā)明專利]檢測人MLH1基因甲基化的試劑盒及其使用方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011415072.4
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112391476A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王志強(qiáng);萬季;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;夏迪;汪健;金泰慶;關(guān)建洪;王弈;宋麒
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市新合生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠和權(quán)律師事務(wù)所 11399
• 代理人: 田春龍

本發(fā)明公開了一種檢測人MLH1基因甲基化的試劑盒及其使用方法。該試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中MLH1基因的甲基化狀態(tài)或水平的特異性引物和探針。本發(fā)明試劑盒能夠顯著提高早期結(jié)直腸癌的陽性檢出率和特異性(真實(shí)陰性率)，可將生物標(biāo)記物的檢測靈敏度提高到皮克/納克級DNA分子，檢測靈敏度的提高是通過優(yōu)化特定核苷酸序列引物及DNA探針以及改進(jìn)血漿游離DNA的亞硫酸氫鹽處理方法來實(shí)現(xiàn)的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于結(jié)直腸癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及其使用方法，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進(jìn)行甲基化qPCR以確定一個或多個目標(biāo)基因靶點(diǎn)(例如MLH1)的甲基化狀態(tài)來用于結(jié)直腸癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

結(jié)直腸癌(CRC)是全世界第三大常見癌癥，每年有600,000人死亡。對于CRC，早期識別和早期干預(yù)是降低死亡率的最佳方法。目前的篩查方法是結(jié)腸鏡檢查和大便隱血和免疫組織化學(xué)檢測(gFOBT/FIT)。由于結(jié)腸鏡檢查的不適以及對腸道制品的厭惡，這些篩查方法并未充分使用。因此，使用可靠的非侵入性血液基礎(chǔ)檢測來評估CRC風(fēng)險對于早期發(fā)現(xiàn)CRC可能是有價值的。

液體活檢是用檢測分子生物標(biāo)志物來替代傳統(tǒng)組織活檢的非侵入性方法，其用于分析的生物樣品(如DNA)可以從血液、尿液、唾液、痰液或組織樣本中獲得。與傳統(tǒng)的癌癥診斷方法相比，液體活檢具有以下優(yōu)勢：

1.易取得，液體活檢樣本可從尿液、唾液和胸腔積液中獲得；

2.比傳統(tǒng)的腫瘤活組織檢查更少侵入性；

3.能取樣所有可能的癌細(xì)胞，而非僅局限于腫瘤活檢的某部分；

4.便于早期發(fā)現(xiàn)癌癥；

5.能用于監(jiān)測腫瘤動態(tài)(治療前、治療間和治療后)；

6.具有能作為理想識別標(biāo)靶治療因子的潛力。

壞死或凋亡的細(xì)胞釋放到血液中的DNA，被稱為循環(huán)游離DNA(circulating freeDNA， cfDNA)，然而在腫瘤患者的血液中，一部分cfDNA來自死亡的腫瘤細(xì)胞，這部分DNA就被定義為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA兩種形式存在，這些ctDNA 多為大約134-144bp的DNA片段，并攜帶一定的腫瘤特征(包括異常甲基化、突變、缺少、插入、拷貝數(shù)等)。較早期的癌癥(意味著腫瘤尺寸較小且癌細(xì)胞較少)，釋放較少的游離循環(huán)腫瘤ctDNA，而其濃度更小于游離cfDNA；當(dāng)腫瘤負(fù)荷增加時，患者的ctDNA水平會升高。迄今為止，ctDNA是獲得癌癥患者血液中分子腫瘤相關(guān)改變的診斷、預(yù)后、以及預(yù)測信息的最佳材料。

DNA甲基化改變是癌癥進(jìn)程中最早發(fā)生的分子變化之一，且具有組織特異性，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達(dá)和促進(jìn)癌細(xì)胞生長和擴(kuò)增的重要機(jī)制。近年研究表明,MLH1(Mutl homolog1)基因是DNA錯配修復(fù)基因的重要組成部分,其基因啟動區(qū)是一個CPG島高密度分布區(qū),這里極易產(chǎn)生甲基化作用。MLH1基因啟動子甲基化后,導(dǎo)致 DNA錯配修復(fù)基因的失活,使得錯配的基因不能得到及時的修復(fù),導(dǎo)致基因突變,進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。在結(jié)直腸癌中，MLH1基因中的CpG(胞嘧啶(C)后接續(xù)鳥苷(G))的高甲基化已被認(rèn)為是癌癥的生物標(biāo)記之一。因此，對MLH1基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析可用于診斷結(jié)直腸癌的狀態(tài)。