[發明專利]檢測人MLH1基因甲基化的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 202011415072.4
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112391476A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 王志強;萬季;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;夏迪;汪健;金泰慶;關建洪;王弈;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所 11399
• 代理人: 田春龍

1.檢測人MLH1基因甲基化的試劑盒，其特征在于，包括檢測或測量受試樣品DNA中MLH1基因甲基化狀態或水平的特異性引物和探針。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括括檢測或測量受試樣品DNA中ACTB基因甲基化狀態或水平的特異性引物和探針。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，包括用于檢測MLH1基因甲基化狀態的特異性引物和探針選自下述三種特異性引物和探針組合中的任一種：特異性引物SEQ IDNO:1-2和探針SEQ ID NO:3、特異性引物SEQ ID NO:4-5和探針SEQ ID NO:6、特異性引物SEQ ID NO:7-8和探針SEQ ID NO:9；

和/或，包括用于檢測ACTB基因甲基化狀態的特異性引物SEQ ID NO:10-11和探針SEQID NO:12。

4.根據權利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11均經過硫代磷酸酯修飾，且在嚴格條件下與甲基化或非甲基化的目標基因區域雜交；

和/或，所述探針SEQ ID NO:3、6、9、12是基于TaqManTM設計的，且在嚴格條件下與甲基化或非甲基化的目標基因區域雜交。

5.根據權利要求1-4任一所述的試劑盒，其特征在于，所述MLH1基因探針SEQ ID NO:3、6、9核苷酸序列5’端標記Cy5，3’端標記QSY；

和/或，所述ACTB基因探針SEQ ID NO:12核苷酸序列5’端標記VIC，3’端標記MGBNFQ。

6.根據權利要求1-5任一所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11和所述探針SEQ ID NO:3、6、9、12的長度為10-50nt。

7.根據權利要求1-6任一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含下述組成部分：dNTP混合溶液、MgCl₂溶液、DNA聚合酶、PCR反應緩沖液、PCR去離子水；

和/或，所述試劑盒中還包含下述組成部分：血漿游離DNA提取試劑和血漿游離DNA甲基化轉化試劑；

和/或，所述血漿游離DNA甲基化轉化試劑為亞硫酸氫鹽；

和/或，所述受試樣品DNA為完整基因組、無細胞DNA或循環腫瘤DNA。

8.一種根據權利要求1-7任一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取血漿游離DNA；

(2)將提取的血漿游離DNA進行甲基化轉化并純化，優選采用亞硫酸氫鹽為血漿游離DNA甲基化轉化試劑；

(3)將進行甲基化轉化并純化的血漿游離DNA進行熒光定量PCR擴增，PCR反應結束后，將Ct閾值設定在線性擴增區間，Ct值小于40的擴增認定為陽性；

(4)結果判定：當內部參照位點ACTB檢測結果陽性，MLH1靶點的三個重復擴增中至少兩個為陽性則確定為該靶點結果陽性；

優選地，所述第(3)步驟中，每個模板的PCR擴增做三個重復；

和/或，每個反應體系10μL，其中含(0.5-1.5μL)1xPCR反應緩沖液、200-400μm dNTPs、3-6mM MgCl₂、1-3U AmpliTaq Gold DNA聚合酶；

和/或，MLH1基因區域靶點的引物各300-500nM；

和/或，MLH1基因區域靶點的探針各200-300nM；

和/或，ACTB基因區域靶點的引物150-250nM，ACTB基因區域靶點的探針50-150nM；

和/或，PCR擴增條件為：90-100℃預變性8-12min；90-100℃變性10-20s，60-70℃退火和延伸60-70s，40-50個循環。