[發明專利]實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011414779.3
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112322795A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 柳勇;劉存昌;朱大鵬;董元舒;童涌
• 申請（專利權）人: 蘇州藥明檢測檢驗有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

本發明提供一種實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的方法及試劑盒。其中引物包括正向引物和逆向引物，如SEQ ID NO:2～3所示；探針，如SEQ ID NO:4所示；QPCR模板，如SEQ ID NO:1所示。本發明通過對NCBI數據庫中所有HHV7基因組DNA和H gene分離株序列共22個做了同源性比對，設計出1組實時定量PCR的正反向引物以及探針，能夠高效、準確的檢測出所有類型的HHV7 DNA，并且不受大量背景細胞DNA的影響，特別適用于檢測生物制藥原料和產品，尤其是細胞庫中的HHV7病毒污染。

技術領域

本發明所屬生物檢測技術領域，特別是涉及運用體外核酸檢測法檢測生物制品中的HHV7病毒污染的方法。

背景技術

人皰疹病毒7型(Human Parvovirus HHV7)于1990年由Frenkel等首次在健康人體外周血活化CD4+T細胞中分離得到，后又在人體的血液和唾液中被分離鑒定。因其基因組與人皰疹病毒6型(HHV6)及人巨細胞病毒(HCMV)約有75％的同源性，故將其歸于一皰疹病毒亞科。臨床上，HHV7與小兒急疹和玫瑰疹等發病密切相關，并與神經系統病變有一定聯系。HHV7引起的原發感染多發生于幼童時期，以引起短暫發熱為主，有時可伴皮疹。當器官移植受者體內潛伏的HHV7病毒被激活后，將出現嚴重并發癥。故近來，人們已經認識到HHV7是一種機會性感染病原，對人體健康產生嚴重影響。

HHV7病毒的檢測方法很多，主要包括抗體檢測技術、抗原檢測技術以及核酸檢測技術。抗體檢測技術不適用于培養細胞的檢測；抗原檢測技術檢測靈敏度較低。核酸檢測技術適用范圍廣，且靈敏度較高，是HHV7檢測的一種較好的選擇。該檢測技術主要包括核酸分子檢測技術和核酸分子擴增檢測技術兩種。

目前，常用的核酸檢測技術為實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR)法。該方法指在PCR擴增過程中，通過熒光信號的強弱，對PCR產物進行實時檢測，從而快速、高效、準確的檢測出HHV7基因組DNA。檢測生物制品中的HHV7病毒的方法需要盡可能多地覆蓋HHV7的變異株。目前文獻公開的HHV7病毒qPCR檢測方法均不能保證覆蓋所有類型的HHV7。

因此，本領域需要提供一種準確的檢測出所有類型的HHV7 DNA的方法，并且該方法不受大量背景細胞DNA的影響，特別適用于檢測生物制藥原料和產品。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供一種能高效、準確的檢測出所有類型的HHV7DNA且不受大量背景細胞DNA的影響的檢測HHV7病毒的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

一種實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的方法，按以下條件進行:

1)提取待測樣品總DNA；可將總DNA的濃度調整為0.1μg/μL；

2)制備反應體系，每份反應體系包括預混液、一對引物及相應的探針；所述預混液為TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列為：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC(如SEQ ID NO:2所示)，所示反向引物的核苷酸序列為：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG(如SEQ ID NO:3所示)；所述探針的核苷酸序列為：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ(如SEQ ID NO:4所示)；