[發明專利]實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011414779.3
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112322795A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 柳勇;劉存昌;朱大鵬;董元舒;童涌
• 申請（專利權）人: 蘇州藥明檢測檢驗有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

1.一種實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的方法，其特征在于，按以下條件進行：

1)提取待測樣品總DNA；

2)制備反應體系，每份反應體系包括預混液、一對引物及相應的探針；所述預混液為TaqMan Universal Master Mix；所述引物包括正向引物和反向引物，

所述正向引物的核苷酸序列為：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，

所述反向引物的核苷酸序列為：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；

所述探針的核苷酸序列為：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ；

3)梯度稀釋DNA模板，得到標準曲線樣品；所述DNA模板的核苷酸序列為：

5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCATGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’；

4)試劑的陰性對照、待測樣品的陰性對照以及加入了標準品的待測樣品上樣；

5)QPCR反應；

6)繪制標準曲線，分析待測樣品的檢測結果。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，標準曲線樣品的濃度梯度為每5μl含有1x10⁵，1x10⁴，1x10³，1x10²及10個靶序列拷貝。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)中，采用ABI 7500PCR儀進行QPCR反應。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟5)中，QPCR反應程序為：

Step1：95℃，10min；

Step2：95℃，15sec，然后60℃，1min；

Step2執行40cycles。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于細胞庫中的HHV7病毒的檢測。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA模板為包含模板靶序列的質粒。

7.一種用于實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的引物及探針的組合，其特征在于，

所述引物包括正向引物和反向引物，

所述正向引物的核苷酸序列為：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，

所示反向引物的核苷酸序列為：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；

所述探針的核苷酸序列為：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ。

8.一種實時熒光定量PCR檢測HHV7病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含引物和探針，

述引物包括正向引物和反向引物，

所述正向引物的核苷酸序列為：GACACATATGCTTGATAATGTCATGGAC，

所示反向引物的核苷酸序列為：CACCTTGTTTGTGTATGCGTCTAGG；

所述探針的核苷酸序列為：FAM-TCCTTGTGCAACAGCCACGCGC-BHQ。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括預混液，所述預混液為TaqMan Universal Master Mix。

10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括QPCR反應的DNA模板；所述DNA模板的核苷酸序列為：

5’ACTCTCAGAAATTGGAAACAGTCTAGTCTTCCAAGAAAAGATCAAGCGAAAGATTCATGTTTTGCTCGCAAGTCTGTGCAATCCTTTGGAAATGTATTTTTGGACACATATGCTTGATAATGTCATGGACATTGAAACGATGTTTTCTCCTTGTGCAACAGCCACGCGCAAAGATTTAACTCAAAGAGTTGTCAACAACATTTTATCCTATAAAAACCTAGACGCATACACAAACAAGGTGATGAACACACTTTCTGTATATAG 3’。