[發明專利]一種構建奧利萬星前體高產工程菌的方法及應用

有效

• 申請號: 202011412528.1
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112430608B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 李永泉;錢輝
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供一種構建奧利萬星前體高產工程菌的方法及應用，所述奧利萬星前體高產菌為Chloroeremomycin，將奧利萬星前體生物合成的正調控基因strR導入產Chloroeremomycin的東方擬無枝酸菌中，從而獲得奧利萬星前體Chloroeremomycin的高產菌，保藏號CGMCC NO.21140。本發明方法避免了傳統誘變育種技術手段帶來的周期長，耗費人力物力的缺點。產量比出發菌提高了40％，達140mg/L，降低了奧利萬星前體的生成成本，可提高奧利萬星前體Chloroeremomycin的生物合成，在奧利萬星前體工業化生產中有重要的應用價值，為開發糖肽類抗生素提供有效的技術手段。

技術領域

本發明屬于藥物生物技術領域，涉及一種構建奧利萬星高產工程菌的方法及其應用。

背景技術

萬古霉素是治療耐藥革蘭氏陽性菌感染的重要糖肽類抗生素，但革蘭氏陽性致病細菌耐藥性問題日趨嚴重，世界各地相繼出現了萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(VISA、VRSA)以及萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)。因此，萬古霉素已不能完全滿足臨床需要，有必要開發新一代糖肽類抗生素藥物。

2014年，美國FDA批準Medicines公司開發的奧利萬星(Oritavancin)上市，商品名為Orbactiv，它是萬古霉素后的新一代糖肽類抗生素。奧利萬星是美國FDA批準用于治療急性細菌性皮膚和皮膚結構感染(ABSSSIs)的首個和唯一的單劑量治療方案的抗生素。奧利萬星注射劑用于治療革蘭陽性細菌導致的ABSSSIs成人感染。

東方擬無枝酸菌是奧利萬星前體Chloroeremomycin(又名A82846B)的生產菌，目前發酵單位較低。因此利用合成生物技術理性重構其合成途徑以提高Chloroeremomycin的發酵水平，對奧利萬星產業化具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種奧利萬星前體高產工程菌的構建方法，所述奧利萬星前體高產菌為Chloroeremomycin，取保藏號為ACCC40175的東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)，經實驗室遺傳育種后成為Chloroeremomycin產生菌，將奧利萬星前體Chloroeremomycin生物合成的正調控基因strR導入，從而獲得Chloroeremomycin高產菌，獲得的Chloroeremomycin產量提高約40％，達140mg/L。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為：東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)L80，保藏號：CGMCC NO.21140，保藏日：2020.11.9。

本發明構建方法具體步驟如下：

(1)購置特異性引物以東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，保藏編號為ACCC40175，分類命名:東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),基因組為模板擴增SEQ ID NO.1序列并回收：

上游引物SEQ ID NO.3：aaaggaggcggacatcatatggtggatccgacgagagtagacc

下游引物SEQ ID NO.4：catgattacgaattcgatatcttacgcgatcgctcccgtgg

(2)步驟(1)中回收的片段插入表達載體psoK804上得到質粒psoK804-ermE*-strR，并驗證；

(3)步驟(2)中獲得的質粒通過化轉導入大腸桿菌E.coil ET12567/pUZ8002中；

(4)通過接合轉導將步驟(2)中的質粒轉入Chloroeremomycin產生菌東方擬無枝酸菌中；

(5)通過發酵并高效液相色譜檢測，原始菌Chloroeremomycin產量提高約40％，達140mg/L。