[發(fā)明專利]一種構(gòu)建奧利萬星前體高產(chǎn)工程菌的方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011412528.1
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112430608B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李永泉;錢輝
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1. 一種構(gòu)建奧利萬星前體高產(chǎn)工程菌的方法，其特征在于，取保藏號為ACCC40175的東方擬無枝酸菌 (Amycolatopsis orientalis)，經(jīng)遺傳育種后成為Chloroeremomycin產(chǎn)生菌，將奧利萬星前體Chloroeremomycin生物合成的正調(diào)控基因strR構(gòu)建到pSOK804質(zhì)粒上導入菌體，整合至VWB位點，從而獲得Chloroeremomycin高產(chǎn)菌，獲得的Chloroeremomycin產(chǎn)量提高40%，達140 mg/L，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為：東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)L80，保藏號：CGMCC NO.21140，保藏日：2020.11.9；所述調(diào)控基因strR的序列如SEQ ID NO.1所述；

具體通過以下步驟實現(xiàn)：

（1）設(shè)計特異性引物以東方擬無枝酸菌 (Amycolatopsis orientalis)基因組為模板擴增SEQ ID NO.1序列并回收：

上游引物SEQ ID NO.3：aaaggaggcggacatcatatggtggatccgacgagagtagacc，

下游引物SEQ ID NO.4：catgattacgaattcgatatcttacgcgatcgctcccgtgg；

（2）步驟（1）中回收的片段插入表達載體psoK804上得到質(zhì)粒psoK804-ermE*-strR，并驗證；

（3）步驟（2）中獲得的質(zhì)粒通過化轉(zhuǎn)導入大腸桿菌E.coil ET12567/pUZ8002中，獲得大腸桿菌E.coil ET12567/pUZ8002/psoK804-ermE*-strR；

（4）通過大腸桿菌E.coil ET12567/pUZ8002/psoK804-ermE*-strR進行接合轉(zhuǎn)導將步驟（2）中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Chloroeremomycin產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌中；

（5）通過發(fā)酵并高效液相色譜檢測，原始菌Chloroeremomycin產(chǎn)量提高40％，達140mg/L。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建奧利萬星前體高產(chǎn)工程菌的方法，其特征在于，步驟（2）中將SEQ ID NO.1的序列插入質(zhì)粒pSOK804后，質(zhì)粒pSOK804-ermE*-strR通過接合轉(zhuǎn)導導入到Chloroeremomycin產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌中。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建奧利萬星前體高產(chǎn)工程菌的方法，其特征在于，SEQID NO.1由975個核苷酸組成，SEQ ID NO.2 為Chloroeremomycin生物合成正調(diào)控基因的氨基酸序列，表達載體pSOK804經(jīng)過NdeI-EcoRV雙酶切后插入SEQ ID NO.1序列，啟動子為含紅霉素抗性基因啟動子erme*p；將表達載體質(zhì)粒pSOK804-ermE*-strR利用接合轉(zhuǎn)移導入Chloroeremomycin產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌中，從而獲得高產(chǎn)奧利萬星前體Chloroeremomycin的菌。

4.權(quán)利要求1所述的方法在構(gòu)建高產(chǎn)奧利萬星前體Chloroeremomycin工程菌中的應用，其特征在于，所產(chǎn)Chloroeremomycin菌產(chǎn)量達140 mg/L。