[發(fā)明專利]評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原風(fēng)險(xiǎn)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011409447.6
• 申請(qǐng)日: 2020-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN114592030A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟如杰;崔以晴;李雨桐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫藥明生物技術(shù)股份有限公司;上海藥明生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/00
• 分類號(hào): C12Q1/00;G01N33/50;G01N33/68;C12Q3/00;C12P21/02
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 錢文宇

本發(fā)明提供一種評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(1)確定生物分子擬閾值還原水平L_th；(2)測(cè)定所述細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液的還原水平L_d；和(3)比較L_d與L_th以判斷還原風(fēng)險(xiǎn)的存在，其中，若L_d大于或等于L_th，則表示有還原風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供一種控制細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原的方法，以及相關(guān)試劑在其中的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及生物制藥領(lǐng)域；具體地，涉及生物分子生產(chǎn)過程中還原風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。

背景技術(shù)

生物分子(例如，抗體)的還原現(xiàn)象常發(fā)生在細(xì)胞培養(yǎng)純化的生產(chǎn)過程中，具體表現(xiàn)為在細(xì)胞培養(yǎng)液收獲澄清后的放置期間，目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，抗體)的亞基間二硫鍵被還原為自由巰基，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)被破壞。

當(dāng)前關(guān)于還原現(xiàn)象的機(jī)理研究已較為全面。還原的發(fā)生主要基于硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)，或基于谷胱甘肽系統(tǒng)。在NADPH的存在下，蛋白質(zhì)的二硫鍵在相關(guān)還原酶的作用下被還原為自由巰基。還原現(xiàn)象的產(chǎn)生主要?dú)w因于細(xì)胞破碎，致使有還原能力的細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中。二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)分子折疊、構(gòu)象和功能具有重要作用。二硫鍵的還原除了會(huì)影響蛋白質(zhì)分子功能之外，還會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子相關(guān)雜質(zhì)，且可能影響產(chǎn)品穩(wěn)定性。

在生物分子生產(chǎn)過程中，預(yù)防上述還原現(xiàn)象的發(fā)生至關(guān)重要。當(dāng)前報(bào)道和采用的防還原措施主要有：通氣(例如，空氣或氧氣)以提高溶氧，通氣并降溫、添加弱氧化劑(例如，硫酸銅)，或過氧化氫，或添加硫氧還蛋白還原酶抑制劑等。防還原措施的采取一方面增加了工藝操作的復(fù)雜性，另一方面還可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。例如已有報(bào)道提出，通氣會(huì)造成生物分子酸性峰增加(參見例如，Mun Melissa等，Biotechnology and bioengineering，2015，112(4))；弱氧化劑的添加會(huì)增加不希望的生物分子氧化風(fēng)險(xiǎn)，抑制劑(如金屬類抑制劑)的添加會(huì)帶來后續(xù)去除的負(fù)擔(dān)且可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，若非必要，盡量不采取防還原措施。如果溫和措施滿足要求，不采取強(qiáng)防還原措施。

本領(lǐng)域迫切需要評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子(例如，抗體)還原風(fēng)險(xiǎn)的方法，以為后續(xù)判斷是否需要采取還原措施和有針對(duì)性地采取防還原措施提供有利支持。

發(fā)明內(nèi)容

經(jīng)長(zhǎng)期研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并提出了評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原風(fēng)險(xiǎn)的方法。所述方法能夠定性、定量地評(píng)估給定生物分子所處的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液的還原水平，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)生物分子發(fā)生還原的可能性及還原程度，以能夠按需采用和選擇適當(dāng)?shù)姆肋€原措施。

所述方法特別地適合用于在目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，抗體)的大規(guī)模生產(chǎn)中實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，抗體)還原風(fēng)險(xiǎn)，為后續(xù)防還原措施的選用提供必要信息，從而一方面避免目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，抗體)在生產(chǎn)過程中的結(jié)構(gòu)的破壞，另一方面避免了不必要的防還原措施對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)質(zhì)量造成的不良影響，和避免了不必要增加生產(chǎn)工藝復(fù)雜性的影響。促進(jìn)了產(chǎn)品產(chǎn)率和質(zhì)量的提高。

一方面，本發(fā)明提供一種評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：

(1)確定生物分子擬閾值還原水平L_th；

(2)測(cè)定所述細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液的還原水平L_d；和

(3)比較L_d與L_th以判斷還原風(fēng)險(xiǎn)的存在，其中，若L_d大于或等于L_th，則表示有還原風(fēng)險(xiǎn)。

另一方面，本發(fā)明提供一種控制細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)上清液中生物分子還原的方法，所述方法包括：

(1)確定生物分子擬閾值還原水平L_th；