[發明專利]一種貓ω干擾素突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011408856.4
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112500472B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 劉昕;賴強;王弋;謝汝祝;鄭飛;彭小珍;歐海航
• 申請（專利權）人: 廣州源博醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;C12N15/81;A61K38/21;A61P31/12;C12R1/84
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 張鳳

本發明屬于干擾素基因工程的技術領域，具體涉及一種貓ω干擾素突變體及其制備方法和應用。所述突變體包括成熟肽貓ω干擾素突變體；所述成熟肽貓ω干擾素突變體為將成熟肽貓ω干擾素進行定點突變得到，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；對貓ω干擾素進行氨基酸位點的突變形成具有糖基化位點的突變體，對畢赤酵母密碼子優化修飾后的貓ω干擾素及貓ω干擾素突變體進行表達，適度的糖基化修飾提高了貓干擾素突變體的生物活性及延長了半衰期，解決現有表達系統及相關生物技術制備的貓干擾素含量低、生物學活性低、半衰期短、穩定性差、二硫鍵難以形成、生產工藝復雜、純化制備成本高等問題。

技術領域

本發明屬于干擾素基因工程的技術領域，具體涉及一種貓ω干擾素突變體及其制備方法和應用。

背景技術

1985年，干擾素ω首次從仙臺病毒誘導的Namalwa細胞中克隆得到。1992年，Nakamura首次分離得到貓干擾素基因，在相關研究基礎上的重組干擾素藥物研制成功并在日本上市，主要用于治療貓杯狀病毒及犬細小病毒病。自IFN-ω被發現以來，因其種屬特異性及更高效的抗病毒活性，一直是國內外研究的熱點。IFN-ω存在于人類、貓科動物、豬、馬、兔子和蝙蝠等動物體中，犬和小鼠體內并未發現。

貓ω干擾素是應用最早的貓干擾素制劑，同時是抗病毒活性最強的貓干擾素。貓ω干擾素具有廣譜性抗病毒作用，其與細胞表面受體結合，誘導細胞產生多種抗病毒蛋白，從而音質病毒在細胞內的復制，對RNA和DNA病毒都有效，FeIFN-α與FeIFN-ω的同源性為94％，雖然兩者之間的同源性很高，但它們之間的抗病毒、抗增殖以及免疫調節的活性存在著巨大差異。有學者還針對FeIFN-α與FeIFN-ω的抗病毒活性進行比較研究，就H9N2亞型禽流感病毒(AIV)和犬瘟熱病毒(CDV)兩種病毒而言，FeIFN-ω的抗病毒活性比FeIFN-α高160倍和4倍。

貓ω干擾素具有加速和強化疫苗的免疫作用，和疫苗聯合使用，可縮短產生抗體的時間，提高機體的抗體水平，其有著出色的抗腫瘤活性，具有可以成為貓乳腺癌首選治療藥物的潛質，但是FeIFN-ω的藥代動力學較差，半衰期較短，半衰期小于2h，半衰期較短限制了FeIFN-ω在臨床中的應用。

現有技術中貓干擾素的相關研究中存在表達量不高、活性低及半衰期短等問題。貓干擾素的外源表達主要在大腸桿菌、畢赤酵母、動物細胞三種表達系統中的表達，在大腸桿菌表達系統缺少將蛋白質有效的釋放分泌機制，面臨產量小、包涵體表達的問題，存在變復性、去除內毒素及熱源等繁瑣的蛋白純化工藝；利用動物細胞表達則存在著工業復雜、成本較高、大規模產業化生產較為困難的情況。

改善IFN-ω的藥學性質，研制安全、高穩定性、長效的IFN-ω對IFN-ω的應用具有廣闊的應用前景。在長效性修飾的研究中，PEG修飾、血清白蛋白修飾、FC蛋白等技術均有利用來提高干擾素的半衰期，PEG修飾及FC蛋白融合表達技術延長了其半衰期，但是抗病毒活性均低于天然IFN-ω。血清白蛋白修飾融合表達時易出現斷裂、酶降解及影響貓干擾素活性等問題，在不同表達系統中融合蛋白的選擇是一個技術性難題。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種貓ω干擾素突變體及其制備方法和應用。對FeIFN-ω進行氨基酸位點的突變形成具有糖基化位點的FeIFN-ω-Mut，提高了貓干擾素突變體的生物活性及延長了半衰期，解決現有表達系統及相關生物技術制備的貓干擾素含量低、生物學活性低、半衰期短、穩定性差、二硫鍵難以形成、生產工藝復雜、純化制備成本高等問題。

本發明的技術內容如下：

本發明提供了一種貓ω干擾素突變體，所述突變體包括成熟肽貓ω干擾素突變體；

所述成熟肽貓ω干擾素突變體(mFeIFN-ω)為將成熟肽貓ω干擾素進行定點突變得到，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示；