[發(fā)明專利]一種貓ω干擾素突變體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011408856.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN112500472B
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉昕;賴強(qiáng);王弋;謝汝祝;鄭飛;彭小珍;歐海航
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州源博醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/555
• 分類號(hào): C07K14/555;C12N15/81;A61K38/21;A61P31/12;C12R1/84
• 代理公司: 廣州專理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44493
• 代理人: 張鳳

1.一種貓ω干擾素突變體，其特征在于，所述突變體為將成熟肽貓ω干擾素進(jìn)行定點(diǎn)突變得到，所述突變體的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所示。

2.由權(quán)利要求1所述的貓ω干擾素突變體，其特征在于，所述定點(diǎn)突變的氨基酸位點(diǎn)為成熟肽貓ω干擾素的第22~24位，第69位，第110位，第165、167位或者第169~171位，或者第181~184位引入新的氨基酸。

3.由權(quán)利要求2所述的貓ω干擾素突變體，其特征在于，所述第22~24位的精氨酸、精氨酸、亮氨酸分別突變?yōu)樘於０贰⒘涟彼帷⑻K氨酸；

所述第69位的亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸；

所述第110位的精氨酸突變?yōu)樘於０罚?/p>

所述第165、167位的蘇氨酸、谷氨酰胺突變?yōu)樘於０贰⑻K氨酸；

所述第169~171位的絲氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸突變?yōu)樘於０贰⒘涟彼帷⑻K氨酸；

所述第181~184位為引入天冬酰胺、亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸。

4.一種權(quán)利要求1所述的貓ω干擾素突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）成熟肽貓ω干擾素重組質(zhì)粒：將成熟肽貓ω干擾素以及蛋白標(biāo)簽新進(jìn)行密碼子優(yōu)化，之后合成于質(zhì)粒載體上，經(jīng)雙酶切后克隆至畢赤酵母表達(dá)載體，連接轉(zhuǎn)化得到重組質(zhì)粒mFeIFN-ω-質(zhì)粒載體；

所述成熟肽貓ω干擾素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；

2）氨基酸突變：將得到的成熟肽貓ω干擾素進(jìn)行氨基酸的定點(diǎn)突變，形成具有糖基化位點(diǎn)的成熟肽貓ω干擾素突變體mFeIFN-ω-mut；

3）突變體表達(dá)：以mFeIFN-ω-質(zhì)粒載體為模板，設(shè)計(jì)相應(yīng)的互補(bǔ)引物，采用環(huán)PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物純化后進(jìn)行DpnI酶消化，純化后的消化產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克隆試劑盒處理后轉(zhuǎn)化DH5α，菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌株并提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化、導(dǎo)入表達(dá)宿主菌得到重組酵母菌，之后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、層析純化得到目的蛋白即貓ω干擾素突變體重組蛋白。

5.由權(quán)利要求4所述的貓ω干擾素突變體的制備方法，其特征在于，步驟1）所述成熟肽貓ω干擾素的核酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示。

6.由權(quán)利要求4所述的貓ω干擾素突變體重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2）所述畢赤酵母表達(dá)載體包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P的一種。

7.由權(quán)利要求4所述的貓ω干擾素突變體重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2）所述宿主菌包括畢赤酵母宿主菌X33、GS115、KM71以及SMD1168的一種。

8.由權(quán)利要求4所述的貓ω干擾素突變體重組蛋白的制備方法，其特征在于，步驟3）所述引物的核酸序列如序列表SEQ ID NO.23~SEQ ID NO.34所示。

9.一種權(quán)利要求1所述的貓ω干擾素突變體用于制備抗病毒藥物。