[發明專利]一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針及檢測方法

在審

• 申請號: 202011406570.2
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112538548A
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 張體銀;邵碧英;黃嫦嬌;王武軍;鄭騰;張志燈;于師宇
• 申請（專利權）人: 福州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明涉及動物衛生技術領域。本發明提供了一組能夠特異性檢測蜜蜂克什米爾病毒的實時熒光RT?PCR的引物和探針，并利用所述的引物組合探針對實時熒光RT?PCR的反應體系和反應程序進行優化得到的非診斷目的的檢測方法。本發明的檢測方法具有以下優點：(1)良好的特異性和敏感性性：對蜜蜂克什米爾病毒的檢測具有高度特異性，與其它蜜蜂病毒無交叉反應，且重復性好；(2)靈敏度高：靈敏度能達到約8拷貝/μL；(3)操作簡單、快速，整個反應可在60分鐘內完成。本發明可用于非診斷為目的的蜜蜂克什米爾病毒的檢測及其與其他蜜蜂病毒病的鑒別，對于保障我國養蜂業和維護自然生態的健康發展具有重要意義。

技術領域

本發明涉及動物衛生技術領域，尤其涉及一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針及其檢測方法。

背景技術

克什米爾蜜蜂病毒(Kashmir bee virus，KBV)最初于1977年從飼喂了患病東方蜜蜂Apis cerana病毒液的西方蜜蜂體內被分離鑒定出來，因為這些東方蜜蜂來源于克什米爾地區，所以研究者就用此地名給這種病毒命名。目前，除了印度和澳大利亞以外，KBV在世界各地的西方蜜蜂群中陸續被報道，但是，人們對于中國境內KBV的傳播與流行情況認識有限。

KBV與其他蜜蜂病毒一樣通過垂直傳播和水平傳播兩種途徑在蜂群內擴散。KBV首先發現于成蜂體內，病毒粒子在進入成蜂血淋巴后幾天內就會導致宿主死亡，因此它被認為是毒力最強的蜜蜂病毒之一。KBV會與其他病毒如SBV共同感染蜜蜂，由于KBV具有較強的快速擴增能力，通常在被多種病毒感染的蜜蜂體內居于主導地位，例如近年間，歐美諸國的西方蜜蜂Apis mellifera蜂群在越冬期間損失的現象愈發嚴重，發生的頻率和死亡蜜蜂的數量也都有所上升。造成這種現象的原因眾說紛紜，其中病毒及病毒與蜂螨間的協同作用被認為是導致蜜蜂死亡和蜂群崩潰的主要誘因之一，而KBV也作為導致蜜蜂死亡的罪魁禍首。該病毒自發現以來就開始在世界范圍內傳播流行，給蜜蜂及其他昆蟲造成巨大損失，已成為養蜂業的主要危害。

目前對蜜蜂病毒病的檢測主要采用免疫學檢測和核酸分子檢測技術。免疫檢測是目前一種常用的快速檢測病毒的方法，但是蜜蜂很多病毒之間具有高度的基因同源性，應用免疫學技術會造成蜜蜂病毒檢測特異性較差，很難對蜜蜂病毒病進行準確診斷。得益于分子生物學的發展，病毒的檢測手段也發生了變革，其中普通PCR檢測被認為是克服蜜蜂病毒檢測障礙的有效手段。對比于傳統的物理學和血清學檢測，自從Stoltz等(1995)開發出第一對蜜蜂病毒的普通PCR引物以來，KBV的檢測就變得方便經濟很多。近年來，TaqMan探針法與SYBR Green熒光法進行KBV病毒定量PCR檢測的手段也已開發利用，其靈敏度相比于傳統的PCR方法高出約1000倍。但是IAPV病毒被確定以來，其與KBV的關系就一直糾纏不清。由于KBV和IAPV具有高度的相似性，核苷酸序列一致性高達97％，以致采用新的IAPV PCR引物和方法對法國境內的西方蜜蜂重新進行病毒篩查，結果只有一個蜜蜂樣本呈現KBV陽性，這與之前的結果大相徑庭，最終分析顯示，之前的KBV屬于IAPV，從而證實了用以檢測KBV引物的特異性不強，不能準確區分KBV和IAPV。因此，急需一種特異性更強，敏感度更高的檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組合和探針及其檢測方法來彌補現有技術的不足，來保障我國養蜂業和自然生態的健康發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組合和探針及其檢測方法。解決了現有技術中檢測蜜蜂克什米爾病毒特異性差，檢測結果不準確等問題。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探針KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探針KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

作為優選，所述TaqMan探針KBV-P的5'端采用熒光基團HEX進行修飾，3'端采用BHQ1進行修飾。