[發(fā)明專利]一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011406570.2
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112538548A
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張體銀;邵碧英;黃嫦嬌;王武軍;鄭騰;張志燈;于師宇
• 申請（專利權(quán)）人: 福州海關(guān)技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針，其特征在于，包括上游引物KBV-F、下游引物KBV-R及TaqMan探針KBV-P；所述上游引物KBV-F的序列如：SEQ ID NO.1所示；所述下游引物KBV-R的序列如：SEQ ID NO.2所示；所述TaqMan探針KBV-P的序列如：SEQ ID NO.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針，其特征在于，所述TaqMan探針KBV-P的5'端采用熒光基團(tuán)HEX進(jìn)行修飾，3'端采用BHQ1進(jìn)行修飾。

3.一種如權(quán)利要求1或2所述的一種檢測蜜蜂克什米爾病毒的引物組和探針擴(kuò)增得到的目的片段，其特征在于，所述擴(kuò)增得到的目的片段的大小為190bp，序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，采用實時熒光RT-PCR進(jìn)行檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，所述實時熒光RT-PCR檢測的反應(yīng)體系包括如下組分和含量：10×RT-PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，2.5mmol/L dNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV-F/KBV-R各0.5μL，10μmol/L探針KBV-P 1.0μL，5U/μL DNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，40U/μL RNA酶抑制劑0.5μL，樣品RNA 2μL，然后加入水9.0μL，使反應(yīng)總體積為20.0μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，所述實時熒光RT-PCR檢測的反應(yīng)程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，61℃退火30s，共40個循環(huán)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，所述61℃退火為單點熒光檢測。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，所述檢測結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：在實驗有效的情況下，樣品無Ct值且無擴(kuò)增曲線，表示樣品中不含蜜蜂克什米爾病毒；待測樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中含有蜜蜂克什米爾病毒；待測樣品Ct值＞35，則對該樣品重復(fù)檢測，重復(fù)檢測結(jié)果無Ct值則該樣品不含蜜蜂克什米爾病毒；重復(fù)檢測結(jié)果有Ct值則該樣品中含有蜜蜂克什米爾病毒。

9.根據(jù)權(quán)利要求4～8任意一項所述的一種非疾病診斷目的檢測蜜蜂克什米爾病毒的方法，其特征在于，所述實驗有效的情況為：陰性對照無Ct值且無擴(kuò)增曲線，同時陽性對照Ct值≤35，并且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，說明實驗為有效實驗。