[發明專利]一種母乳中寡糖含量的定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011404481.4
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN114594169A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;李佳齊;閆競宇;鄭義;郭志謀
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/34;G01N30/86
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種母乳中游離寡糖的快速定量檢查方法。其特征是，樣品經過低溫離心除脂，加入有機溶劑除蛋白后，使用由24種寡糖標準品建立的色譜質譜聯用的定量分析方法，實現母乳中寡糖的全面快速定量。該方法具有高通量，定量全面，靈敏度高，精確性好，穩定性佳的特點。適用于哺乳動物母乳寡糖的全面、快速定量檢測。

技術領域

本發明涉及一種母乳中游離寡糖的絕對含量測定的方法，適用于母乳 樣品快速、高通量分析。

技術背景

在嬰兒的生長發育過程中，來源于母乳的寡糖起著至關重要的作用， 如抗炎、抗感染、免疫調控和維持腸道菌群平衡。其中酸性寡糖在體內起 著不可替代的作用，如預防癌癥發生、促進嬰兒腦的正常發育等功能。

準確快速的對母乳中寡糖進行定量分析，是進一步進行母乳寡糖研究 的必要手段。高通量的定量檢測能夠全面分析母乳中寡糖含量，完成大量 人群樣本中寡糖含量的分析以及跟蹤寡糖含量隨哺乳期的變換，獲得隊列 樣本信息，這都為進一步開展寡糖的生物功能研究和更好的利用人乳寡糖 提供有利信息。然而，由于母乳成分復雜，寡糖種類和結構復雜多樣，異 構體分離和鑒定困難，高通量的完成多種異構體的準確定量存在很大挑戰。

串聯質譜能夠提供更多的化合物信息，為異構體的鑒定和定量提供幫 助，液相色譜與質譜串聯，能夠為質譜提供有效的前一級分離，合理的減 少共流出，使得質譜定量穩定性準確性提升。因此，本發明設計一種新的 母乳寡糖含量的快速定量檢測方法，利用液相色譜與質譜串聯，調整優化 液相分離條件和質譜參數信息，實現24中寡糖的高通量絕對定量。

發明內容

本發明涉及一種母乳中游離寡糖的快速定量檢查方法。其特征是，樣 品經過低溫離心除脂，加入有機溶劑除蛋白后，使用由24種寡糖標準品建 立的色譜質譜聯用的定量分析方法，實現母乳中寡糖的全面快速定量。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種母乳中寡糖含量的快速定量方法：使用24種寡糖標準品,選取合適 的色譜分離填料，在適當的液相條件下進行分離，同時以標準品建立的質 譜多通道定量方法繪制標準曲線，對前處理后的母乳中游離寡糖進行定量 監測，得到母乳中游離寡糖的絕對含量信息。

所述24種寡糖標準品如圖1所示。

24種寡糖標準品結構信息

1.使用的色譜分離填料包括但不僅限于:硅膠或硅膠表面鍵合極性基團 的填料，其結構式如下

其中SiO2為硅膠，R為極性基團，有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖 基和兩性離子等中的一種或幾種

2.洗脫液中的有機溶劑為甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一種或幾種。

3.緩沖鹽類型及其于流動相中的濃度及pH如下：

a)甲酸銨緩沖鹽，濃度0-200mM，pH 2.0-7.0；

b)乙酸銨緩沖鹽，濃度0-200mM，pH 2.0-7.0；

c)碳酸氫銨緩沖鹽，濃度0-200mM，pH 6.0-9.0；

4.優化流動相梯度如下：

流動相水或者緩沖鹽水溶液和有機溶劑作為洗脫液，混合比例為 5/95～95/5。

5.母乳均質步驟為：冷凍母乳樣品于2-20℃解凍；超聲不少于1分鐘， 渦旋震蕩不少于5秒，上述步驟重復不少于1次后，取出樣品中間層完成 母乳的均質取樣；

6.母乳的低溫除脂質步驟為：取均質母乳樣品，于500-50000g離心 5-500分鐘，重復不少于1次后，取出下層透明/半透明溶液即完成母乳樣品 的低溫除質；