[發明專利]基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011403571.1
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112546241B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 郝雪芳;蓋微微
• 申請（專利權）人: 內蒙古民族大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/46;A61K47/42;A61K47/34;A61P9/14;C12N5/078
• 代理公司: 深圳紫晴專利代理事務所(普通合伙) 44646
• 代理人: 陳映輝

本發明涉及基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統的制備方法，具體包括以下步驟：1)納米血小板膜液的制備：2)基因復合物的制備：3)按樣品4和BSA?PEI以1?8微升:10微克的比例，將樣品4滴加到基因復合物中，得到基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統。以上制備方法制備的基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統。基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統在制備基因遞送藥物的應用。本發明優點在于：顯著提升材料生物相容性及基因負載能力，大大降低細胞毒性，在基因復合物表面包裹血小板膜，用作基因遞送系統，提高其免疫規避能力、體內穩定性及基因遞送效率，大大提升內皮細胞遷移和增殖能力，從而達到更好地治療疾病的目的。

技術領域

本發明屬于分子生物領域，涉及一種基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統及其應用。

背景技術

術后血管再狹窄在經皮冠狀動脈介入術(PCI)治療心血管疾病中難以避免，已成為目前最關鍵的問題。由于血管內皮損傷是術后血管再狹窄的主要原因，單純的抗凝、抗炎和抗增殖策略不能完全抑制血管再狹窄。因此，促進損傷血管的快速內皮化是抑制術后血管再狹窄發生的一種非常有前途的策略。

隨著基因治療在疾病治療中的發展，在改善血管再內皮化方面具有很大的發展潛力。近年來，基因遞送領域研究非常廣泛。安全有效的基因載體可以高效遞送治療基因，且能避免對正常組織和細胞的損傷。然而，基因載體在實際應用中仍然面臨著很多問題包括生物相容性差、體內穩定性及免疫規避能力差等，難以獲得性能優良的基因遞送系統。目前，基因載體的材料主要是一些陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺(PEI)、聚甲基丙烯酸-N、N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)等。一般來說，為了獲得高轉染效率，需要高分子量的陽離子聚合物，但高分量的陽離子聚合物會顯著增加細胞毒性，很難到達基因遞送并治療疾病的目的。因此，安全、高效、穩定且具有免疫規避能力的基因遞送系統的設計仍面臨著很大的挑戰。隨著仿生納米載體的出現及研究的不斷深入，很多種細胞膜可以用于納米載體表面修飾，賦予其更好的生物相容性及穩定性等。針對血管類疾病設計的載體材料來說，血小板膜表面修飾成為一種提高載體性能的有效策略，常用作藥物載體。并且，由于血管內皮損傷會導致血小板聚集這一特點，能夠賦予其對血管內皮損傷局部靶向性，有利于提高藥物在損傷部位的累積，提高藥物遞送效果。但是，在促內皮化及內皮細胞遷移和增殖方面，血小板膜修飾研究較少，且很少用于制備基因遞送系統，進行基因治療。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統、制備方法和應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

1、為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為：基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統的制備方法，具體包括以下步驟：

1)納米血小板膜液的制備：

(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的檸檬酸鈉緩沖溶液，阻止其凝血，在200g轉速、37℃條件下離心10分鐘，得到富含血小板的血漿上層；然后在2000×g再次離心10分鐘，棄去上清液，得到血小板粗品，將血小板重懸于0.9毫升pH＝7.4的PBS緩沖液中，再加入0.1毫升的檸檬酸鈉緩沖溶液，然后以2000×g離心10分鐘，棄去上清液，得到純凈的血小板沉淀，懸浮于0.5毫升PBS緩沖液中，得到血小板懸浮液，為樣品1；所述檸檬酸鈉緩沖溶液和所述血液體積比為1:8-1:10；

(1b)向樣品1中滴加5微升TritonX-100細胞裂解液，裂解血小板；然后以20000×g離心10分鐘，棄去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS緩沖液并反復吹打，得到血小板膜懸液粗品；再次以20000×g離心10分鐘，棄去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS緩沖液，反復吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜懸液，為樣品2。

(1c)用pH＝7.4的PBS緩沖液將樣品2稀釋至8毫升，通過脂質體擠出器來回擠壓過200-800納米的聚碳酸酯薄膜，反復進行至少10次，收集血小板膜囊泡液為樣品3；