[發(fā)明專利]基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011403571.1
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112546241B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝雪芳;蓋微微
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古民族大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/46;A61K47/42;A61K47/34;A61P9/14;C12N5/078
• 代理公司: 深圳紫晴專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44646
• 代理人: 陳映輝

1.基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

1)納米血小板膜液的制備：

(1a)取2毫升相同血型的血液，加入0.2毫升0.1M的檸檬酸鈉緩沖溶液，阻止其凝血，在200g轉(zhuǎn)速、37℃條件下離心10分鐘，得到富含血小板的血漿上層；然后在2000×g再次離心10分鐘，棄去上清液，得到血小板粗品，將血小板重懸于0.9毫升pH＝7.4的PBS緩沖液中，再加入0.1毫升的檸檬酸鈉緩沖溶液，然后以2000×g離心10分鐘，棄去上清液，得到純凈的血小板沉淀，懸浮于0.5毫升PBS緩沖液中，得到血小板懸浮液，為樣品1；所述檸檬酸鈉緩沖溶液和所述血液體積比為1:8-1:10；

(1b)向樣品1中滴加5微升TritonX-100細胞裂解液，裂解血小板；然后以20000×g離心10分鐘，棄去上清液；再加入1毫升pH＝7.4的PBS緩沖液并反復(fù)吹打，得到血小板膜懸液粗品；再次以20000×g離心10分鐘，棄去上清液，得到血小板膜沉淀，加入0.5毫升pH＝7.4的PBS緩沖液，反復(fù)吹打血小板膜沉淀，得到血小板膜懸液，為樣品2；

(1c)用pH＝7.4的PBS緩沖液將樣品2稀釋至8毫升，通過脂質(zhì)體擠出器來回擠壓過200-800納米的聚碳酸酯薄膜，反復(fù)進行至少10次，收集血小板膜囊泡液為樣品3；

(1d)將樣品3超聲1-2小時，得納米血小板膜液為樣品4，備用；

2)基因復(fù)合物的制備：

(2a)將50毫克牛血清蛋白溶于40毫升超純水中，加入NHS和EDC，室溫反應(yīng)2小時； 然后，加入PEI，繼續(xù)反應(yīng)4小時，將混合溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中透析2-4天，凍干，得到接枝PEI的BSA聚合物BSA-PEI；所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺；所述EDC為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；所述的PEI為聚乙烯亞胺；所述BSA、NHS、EDC和PEI的比例為1:5-50:5-50:10-100；所述PEI分子量為0.6-10kDa；

(2b)以pH＝7.4的PBS緩沖液為溶劑，配制濃度為0.1-2毫克/毫升的BSA-PEI溶液；

(2c)用pH＝7.4的PBS緩沖液配制基因溶液，攪拌后將基因溶液滴加到BSA-PEI溶液中，孵育1-2小時，得到基因復(fù)合物；所述BSA-PEI聚合物與基因的質(zhì)量比為0.01-10；

3)按樣品4和BSA-PEI以1-8微升:10微克的比例，將樣品4滴加到基因復(fù)合物中，得到基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征在于：所述的基因溶液為VEGF質(zhì)粒溶液或Cy5標記的寡核苷酸溶液。

3.權(quán)利要求1或2的制備方法制備的基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)。

4.權(quán)利要求3的基于蛋白和血小板膜修飾的基因遞送系統(tǒng)在制備基因遞送藥物的應(yīng)用。