[發明專利]三角帆蚌性別的鑒定方法

在審

• 申請號: 202011401255.0
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112481388A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 汪桂玲;王雅昱;王曉強;白志毅;李家樂
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種三角帆蚌性別的鑒定方法，首先，采集少量的性腺組織樣本提取DNA；其次，根據M型COII基因多出的特異性序列設計引物進行PCR擴增；最后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶結果判斷雌雄，有條帶的是雄性三角帆蚌，沒有條帶的為雌性三角帆蚌；本發明主要是根據三角帆蚌的基因組雙單親遺傳現象，利用M型線粒體基因組中COII基因在雄性性腺中特異性表達的特點，結果簡單直觀，從而準確地鑒定三角帆蚌的性別；因此，本發明能夠有效地針對三角帆蚌早期苗種，快速分辨性別，受樣本局限性較小，準確性高；另外，本發明使用DNA樣本通過凝膠電泳來判斷更加快速簡單，無需后續的測序結果，大大縮短檢測時間，從而提高了檢測效率。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種三角帆蚌性別的鑒定方法。

背景技術

三角帆蚌俗稱河蚌、珍珠蚌、三角蚌，是一種淡水雙殼類軟體動物，屬瓣鰓綱，真瓣鰓目，珠蚌科、帆蚌屬。它是我國主要的淡水珍珠育珠蚌，國內的淡水珍珠中80％以上都是由其育出。在性成熟三角帆蚌個體中，雌雄間在產珠性能方面存在顯著差異，雄性具有更好的育珠能力。挑選出雄性三角帆蚌進行精細化養殖，對珍珠產能的提升具有較大的意義。但在實際生產中，雌雄蚌的性別鑒定仍是一個難題。從形態學來看，對三角帆蚌直觀地進行性別鑒定比較困難，有研究發現三角帆蚌雌性鰓絲排列緊密，雄性排列稀疏，通過鰓絲的疏密就能區分雌雄。但是這種方法是建立在人為經驗的判斷上，適用于有經驗的人員，并且該方法只能針對性成熟的且處在繁殖期的三角帆蚌，局限性較大，且鑒定的準確程度不高。此外，若想更好的為后續育珠插核做準備，構建單性別育珠群體，則需盡早的鑒別出三角帆蚌的性別，因此，幼齡三角帆蚌的性別鑒定對于淡水珍珠養殖也是至關重要的。綜上所述，建立一種三角帆蚌性別鑒別的方法就顯得尤為重要。

在哺乳動物和其他物種中，線粒體的遺傳遵循嚴格的母系遺傳，即子代的線粒體全部來源于母系，而在三角帆蚌中存在兩種類型的線粒體基因組(mtDNA)，分別是F型線粒體基因組和M型線粒體基因組。雄性三角帆蚌體組織中線粒體基因組為F型，性腺組織線粒體基因組為M型；雌性中線粒體基因組在體組織和性腺組織中均為F型?；谶@種特殊的線粒體基因組的遺傳模式，通過對比三角帆蚌F型和M型線粒體基因組序列發現，參與編碼線粒體基因組的 13個編碼基因都存在一定程度上的序列差異，尤其是COII基因的序列差異性最大。M型線粒體基因組COII基因序列比F型線粒體基因組COII基因的5’端多出500bp的特異性序列，并且根據M 型線粒體基因組僅存在于雄性性腺中這一特點，我們開發出一種快速準確的性別鑒定方法。

發明內容

針對現有技術中的不足，與傳統方法相比，根據分子生物學的方法判斷準確，不局限于樣本的時間階段，能夠實現幼齡三角帆蚌性別的精準快速檢測，因此本發明提供了一種新的鑒定方法，補足了技術空缺。故本發明的目的是提供一種簡單、準確的三角帆蚌性別的鑒定方法，通過對M型線粒體基因組上COII基因簡單的PCR擴增就能夠確定三角帆蚌的性別，為三角帆蚌的性別鑒定提供便利。

為達到上述目的，本發明的解決方案是：

一種三角帆蚌性別的鑒定方法，其包括如下步驟：

1.樣本采集

根據檢測需求選取若干樣本，使用不同套的鑷子和剪刀等取樣工具避免交叉污染，剪取三角帆蚌的50-100mg新鮮性腺組織裝入1.5mL滅菌離心管中，快速置于液氮中速凍，采樣結束后在-80℃下保存；加入500μL裂解液，用研磨杵充分將組織磨碎，再補充500μL裂解液，開始裂解；在55℃下裂解3-4h至澄清，過程中每0.5-1h翻轉搖動一次。

其中，裂解液包括320μL雙蒸水ddH₂O、20μL(1mol/L)三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽Tris-Hcl、 80μL(0.5mol/L)乙二胺四乙酸二鈉EDTA-Na₂；70μL(10wt％)癸二酸二酰肼SDS和10μL (20mg/μL)蛋白酶kProteinase K。

2.DNA提取