[發明專利]三角帆蚌性別的鑒定方法在審
| 申請號： | 202011401255.0 | 申請日： | 2020-12-04 |
| 公開（公告）號： | CN112481388A | 公開（公告）日： | 2021-03-12 |
| 發明（設計）人： | 汪桂玲;王雅昱;王曉強;白志毅;李家樂 | 申請（專利權）人： | 上海海洋大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/6879 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227 | 代理人： | 范艷靜 |
| 地址： | 201306 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 三角帆 性別 鑒定 方法 | ||
1.一種三角帆蚌性別的鑒定方法，其特征在于：其包括如下步驟：
(1)、剪取三角帆蚌的性腺組織放入滅菌離心管中，加入裂解液使其裂解；在55℃下裂解3-4h至澄清，過程中每0.5-1h翻轉搖動一次；
(2)、加入苯酚，上下顛倒，離心；吸取上清液，加入體積比為25:24:1的苯酚：氯仿：異戊醇，上下顛倒，離心；吸取上清液，加入體積比為24:1的氯仿：異戊醇，上下顛倒，離心；吸取上清液，加入冰乙醇，低溫靜置30min，離心；棄上清液，用冰乙醇洗滌，離心，并將沉淀物在無菌環境下干燥；
(3)、在干燥后的沉淀物中加入雙蒸水溶解DNA，4℃放置過夜溶解；測定濃度和純度，濃度測定完成后加入雙蒸水調節濃度；
(4)、以DNA為模板，設計引物進行PCR擴增；
(5)、配制瓊脂糖凝膠，待凝膠凝固后，將PCR產物點入凝膠孔中，觀察電泳結果。
2.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(1)中，所述裂解液的成分包括雙蒸水、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉、癸二酸二酰肼和蛋白酶k。
3.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(2)中，所述顛倒的時間均為8±0.1min；所述離心的轉速均為11000±100r/min，時間均為5-10min，溫度均為6±0.1℃。
4.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(4)中，所述引物中正向引物序列為：SEQ ID NO.1，反向引物序列為：SEQ ID NO.2。
5.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(4)中，所述PCR擴增的體系為：DNA模板為1μL，正向引物和反向引物各為1μL，2×Taq-mix酶為12.5μL，最后用ddH2O補足至25μL。
6.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(4)中，所述PCR擴增的條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸1min，共35個循環，最后72℃延伸5min。
7.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于：步驟(5)中，所述電泳結果為：如果有電泳條帶則為雄性，沒有電泳條帶則為雌性。
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