[發明專利]一種人工微粒皮的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202011399517.4
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112472870A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 詹日興;趙小紅;羅高興;郭熠城
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/60;A61L15/40;A61L15/46
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

1.一種人工微粒皮的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

S1，脫細胞真皮基質微粒的制備；

S11，取動物離體皮膚消化、分離，去表皮組織保留真皮組織；

S12，將真皮組織粉碎為微粒并加入EDTA-胰蛋白酶溶液，進行震蕩脫細胞處理，得到脫細胞真皮基質微粒；

S2，表皮干細胞分離培養；

S21，取術后皮膚消化、分離，去真皮組織保留表皮組織；

S22，將表皮組織粉碎、消化、過濾、離心，收集細胞；

S23，以K-SFM或Epilife培養液調整細胞濃度為(1～2)×10⁶個細胞/25cm²，接種于采用Ⅳ型膠原包被處理的培養瓶中，常規培養至60～70％細胞融合，采用胰蛋白酶消化后傳代培養，得到表皮干細胞；

S3，脫細胞真皮基質微粒與表皮干細胞的結合；

S31，將S1制得的脫細胞真皮基質微粒在溫度為4～8℃的條件下、采用Ⅳ型膠原溶液浸泡包被12～18h，復溫至室溫，得到濃度為0.01～0.05g/ml的脫細胞真皮基質微粒懸浮液；

S32，將脫細胞真皮基質微粒懸浮液滴加到細胞培養板中，采用K-SFM或Epilife培養液重懸細胞培養板中的脫細胞真皮基質微粒；

S33，取S2中培養對數期的表皮干細胞消化、收集，調整濃度為0.2～0.5×10⁶個細胞/ml，加入到細胞培養板中，培養制得人工微粒皮。

2.根據權利要求1所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于，所述S11中的消化和分離具體為：將動物離體皮膚經70～75％乙醇浸泡后用PBS溶液清洗，刮除多余的體毛及皮下附帶的脂肪組織；然后用0.2～0.5中性蛋白酶在溫度為4～8℃的條件下消化處理12～18h，分離得到表皮組織和真皮組織。

3.根據權利要求1或2所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于：所述S12的EDTA-胰蛋白酶溶液中EDTA的濃度為0.01～0.03，胰蛋白酶的濃度0.25～0.5％。

4.根據權利要求1或2所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于，所述S12的震蕩脫細胞處理具體為：將帶有真皮組織微粒的EDTA-胰蛋白酶溶液置于恒溫震蕩儀中，在轉速為80～100rpm的條件下震蕩18～24h，然后用PBS溶液洗滌兩次，超聲震蕩30min后用PBS溶液漂洗18～24h，震蕩和漂洗過程中均每隔4～6h換液一次。

5.根據權利要求1或2所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于，所述S22的粉碎、消化、過濾、離心具體為：將表皮組織剪碎，在溫度為37℃的條件下用濃度為0.25～0.5％(W/V)的胰蛋白酶溶液消化10～15min，采用RPMI1640培養基終止消化，再用200目篩網過濾，然后在轉速為800～1000rpm的條件下離心4～8min。

6.根據權利要求1或2所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于，所述S23具體為：以K-SFM或Epilife培養液調整細胞濃度為(1～2)×10⁶個細胞/25cm²，接種于采用Ⅳ型膠原包被處理的培養瓶中，常規培養10～15min，吸棄未貼壁細胞；再采用PBS溶液輕洗兩次，更換新的K-SFM或Epilife培養液進行常規培養，次日換液，然后每隔三天換液一次；使用倒置相差顯微鏡觀察到60～70％細胞融合時，采用濃度為2.5～5g/L的胰蛋白酶溶液消化3～8min，收集細胞且將收集的細胞均分四份傳代培養。

7.根據權利要求1或2所述的人工微粒皮的制備方法，其特征在于：所述S1中的動物離體皮膚為人、豬、兔、牛、羊或鼠的皮膚。

8.權利要求1～7任一項所述制備方法的制得的人工微粒皮在燒傷創面修復中的應用。