[發明專利]一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法及應用

有效

• 申請號: 202011399443.4
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112462062B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發明（設計）人: 龐希寧;張濤;賀丹;龐然;趙峰
• 申請（專利權）人: 沈陽艾米奧生物工程技術研發中心有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;C12N5/071;A61K38/44;A61P17/02
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍

本發明涉及一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法及應用，本發明鑒定了羊膜上皮干細胞和羊膜間充質干細胞外分泌蛋白組，并對結果進行了分析整合，對它們的差異表達蛋白進行了進一步的分析。篩選出對上皮發育和表皮再生的積極因子LOXL2，對后續羊膜干細胞旁分泌作用的研究提供了詳實的基礎和新的思路。LOXL2為臨床大面積難愈合創面的在上皮化提供了新的思路，為更好的挖掘不同羊膜干細胞外分泌蛋白的特點提供了方向。為特異性無細胞敷料的開發與臨床應用提供了基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及羊膜干細胞外分泌蛋白LOXL2的篩選鑒定和應用。

背景技術

人羊膜是胎膜最內層，其主要由外胚層的羊膜上皮干細胞和中胚層的羊膜間充質干細胞組成。多在胎兒分娩后隨胎盤廢棄。研究發現：人羊膜可作為一種新型的生物敷料應用于臨床急慢性創口的輔助性治療中。已有研究報道，冷凍或輻照處理后的羊膜組織依然在動物創傷模型或者臨床創面的愈合中具有促進創面的愈合、降低炎癥反應、減少瘢痕的發生等等方面有顯著的療效。由此證明羊膜旁分泌物質有巨大的研究價值和臨床意義。然而，羊膜上皮干細胞和羊膜間充質干細胞的外分泌蛋白組并尚未明晰。

賴氨酰氧化酶同系物2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)作為轉錄輔阻遏物，并且特異性介導組蛋白H3(H3K4me3)的三甲基化'Lys-4'的脫氨基作用，其是表觀遺傳轉錄激活的特異性標記。LOXL2可能通過介導組蛋白H3的脫氨基，與SNAI1的相互作用參與上皮至間質轉化(EMT)并參與E-鈣粘蛋白CDH1的抑制。當分泌到細胞外基質中時，通過介導纖維膠原和彈性蛋白的前體中的肽基賴氨酸殘基的氧化脫氨作用來促進細胞外基質蛋白的交聯，并且可以在上皮發育調節，細胞生長控制和血管生成等方面有額外的作用。

對于創傷愈合，角質形成細胞作為表皮的主要組成細胞承擔了再上皮化的重要任務。已有文獻報道羊膜上皮干細胞的條件培養基促進角質形象細胞遷移，并在小鼠體內實驗證明條件培養基有促進創口愈合和再上皮化的作用。而羊膜間充質條件培養基對于再上皮化的機制并未明晰。

發明內容

發明目的：

本發明提出一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法及應用，其目的是從羊膜干細胞外分泌蛋白中篩選鑒定出LOXL2，并驗證該蛋白有促進角質形成細胞遷移的作用，促進創面再上皮化，提出LOXL2的一種新應用。

技術方案：

一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，步驟如下，

步驟一：羊膜間充質干細胞與羊膜上皮干細胞的提取、培養與鑒定，分別得到羊膜間充質干細胞和羊膜上皮干細胞；

步驟二：將步驟一中得到的羊膜間充質干細胞與羊膜上皮干細胞分別持續培養到P2，分別接種于培養瓶中培養22-26h；用PBS洗2-5次，將培養基換成無血清培養基，22-26h后收集無血清培養基，于-80℃冰箱保存，分別獲得羊膜間充質干細胞的條件培養基和羊膜上皮干細胞的條件培養基；

步驟三：分別將步驟二中保存的羊膜間充質干細胞的條件培養基和羊膜上皮干細胞的條件培養基取出、融化、濃縮后，分別進行液相色譜-質譜聯用分析，鑒定出羊膜間充質干細胞與羊膜上皮干細胞外分泌蛋白，分別進一步篩選出它們的差異表達蛋白，分別對篩選出的差異表達蛋白進行GO、KEGG和蛋白質結構域進行整合分析，鑒定出羊膜干細胞的外分泌蛋白LOXL2。

步驟一中羊膜間充質干細胞與羊膜上皮干細胞的提取、培養與鑒定的具體步驟為：

(1)羊膜間充質干細胞或者羊膜上皮干細胞的提取、培養；

(2)羊膜間充質干細胞或者羊膜上皮干細胞進行流式細胞檢測、鑒定；

(3)羊膜間充質干細胞或者羊膜上皮干細胞進行成骨、成脂、成軟骨分化誘導。