[發(fā)明專利]一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011399443.4
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112462062B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 龐希寧;張濤;賀丹;龐然;趙峰
• 申請（專利權）人: 沈陽艾米奧生物工程技術研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;C12N5/071;A61K38/44;A61P17/02
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍

1.一種羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：步驟如下，

步驟一：羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞的提取、培養(yǎng)與鑒定，分別得到羊膜間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮干細胞；

步驟二：將步驟一中得到的羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞分別持續(xù)培養(yǎng)到P2，分別接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)22-26h；用PBS洗2-5次，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，22-26h后收集無血清培養(yǎng)基，于-80℃冰箱保存，分別獲得羊膜間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基和羊膜上皮干細胞的條件培養(yǎng)基；

步驟三：分別將步驟二中保存的羊膜間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基和羊膜上皮干細胞的條件培養(yǎng)基取出、融化、濃縮后，分別進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，鑒定出羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞外分泌蛋白，分別進一步篩選出它們的差異表達蛋白，分別對篩選出的差異表達蛋白進行GO、KEGG和蛋白質(zhì)結構域進行整合分析，鑒定出羊膜干細胞的外分泌蛋白LOXL2。

2.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：步驟一中羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞的提取、培養(yǎng)與鑒定的具體步驟為：

（1）羊膜間充質(zhì)干細胞或者羊膜上皮干細胞的提取、培養(yǎng)；

（2）羊膜間充質(zhì)干細胞或者羊膜上皮干細胞進行流式細胞檢測、鑒定；

（3）羊膜間充質(zhì)干細胞或者羊膜上皮干細胞進行成骨、成脂、成軟骨分化誘導。

3.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：步驟一中通過表面標記物分別鑒定出羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞。

4.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：無血清培養(yǎng)基是EpiLife基礎培養(yǎng)基中添加0.1-0.3% v/v的牛垂體提取物、0.01-0.03 μg/mL人胰島素樣生長因子、0.15-0.20μg/mL皮質(zhì)醇、3-5μg/mL的牛轉(zhuǎn)鐵蛋白以及0.2-0.4 ng/mL的人表皮生長因子。

5.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：步驟三中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant (v1.5.2.8)進行檢索注釋。

6.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：步驟三中，根據(jù)鑒定出羊膜間充質(zhì)干細胞與羊膜上皮干細胞外分泌蛋白，以p-value0.05，Log2FC1.5為基礎進一步篩選出它們的差異表達蛋白進行GO、KEGG和蛋白質(zhì)結構域進行整合分析。

7.根據(jù)權利1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的篩選鑒定方法，其特征在于：羊膜間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮干細胞的高表達蛋白包括LOXL2、CTHRC1和LGASL1，且羊膜間充質(zhì)干細胞的高表達蛋白LOXL2、CTHRC1和LGASL1比羊膜上皮干細胞分泌量高。

8.一種如權利要求1所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的應用，其特征在于：羊膜干細胞外分泌蛋白LOXL2在促進角質(zhì)形成細胞遷移，促進創(chuàng)面再上皮化的應用。

9.根據(jù)權利要求8所述的羊膜干細胞外分泌蛋白的應用，其特征在于：LOXL2作為促進創(chuàng)口愈合和再上皮化藥劑的應用。