[發明專利]一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝

在審

• 申請號: 202011399412.9
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112514888A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 周自豪;強斌;廉云飛
• 申請（專利權）人: 江蘇拓弘康恒醫藥有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產權代理事務所(普通合伙) 32509
• 代理人: 胡麗華

1.一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：清洗處理：首先使用消毒后的手術剪刀將臍帶組織進行剪開和鋪開，并且對鋪開后的臍帶組織進行固定處理，然后使用消毒液對臍帶組織的表面進行清理，清理時，使用棉球蘸消毒液對臍帶表面進行反復消毒清理，消毒清理的次數為3-5次，然后使用細胞前處理清洗緩沖液對臍帶組織進行清洗處理，清洗時，使用棉球蘸緩沖液進行反復清洗，清洗的次數為3-5次，從而有效的降低臍帶組織上紅細胞的比例，然后對臍帶組織進行收集待用；

步驟二：消化處理：然后對步驟一中得到的臍帶組織進行剪碎處理，剪碎處理時，控制臍帶組織剪碎的大小，使得單塊的臍帶組織的上端面面積控制在0.08cm²-0.2cm²，然后對剪碎之后的臍帶組織內加入胰酶和EDTA進行消化處理，消化處理時，使得胰酶和EDTA完全浸沒臍帶組織，并且在消化處理時，進行反復翻動臍帶組織，然后在消化處理之后去除臍帶組織，然后在酶解液中加入間充質干細胞培養基，從而終止消化，最后清洗酶解之后得到的細胞，最終獲得細胞懸液；

步驟三：細胞培養：對步驟二中得到的酶解消化后的細胞進行離心處理，在離心處理時，采用5000rpm-8000rpm的轉速進行離心處理，保證細胞的破裂，然后在完全培養基重選后，進行密度傳代，細胞連續生長24h-72h；

步驟四：離心取上清：對步驟三中得到的液體進行離心處理，在離心處理時，采用1500rpm-1800rpm的轉速進行離心處理，離心處理的時間為10-15分鐘，然后進行取上清備用；

步驟五：冷凍處理：對步驟四中得到的上清中進行加入二甲基亞砜，然后進行混合處理，在混合處理后，然后進行低溫過夜保存，最后再轉入液氮中進行長期的保存處理。

2.根據權利要求1所述的一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，其特征在于：所述步驟二中向細胞中加入0.02mL/cm²的0.2％的胰酶和0.03％的EDTA，并且消化時間為20min。

3.根據權利要求1所述的一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，其特征在于：所述步驟二中向細胞中加入0.01mL/cm²的0.3％的胰酶和0.04％的EDTA，并且消化時間為15min。

4.根據權利要求1所述的一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，其特征在于：所述步驟二中向細胞中加入0.03mL/cm²的0.1％的胰酶和0.02％的EDTA，并且消化時間為25min。

5.根據權利要求1所述的一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，其特征在于：步驟三中按照5000個細胞/cm²-8000個細胞/cm²的傳代密度進行傳代。