[發(fā)明專利]一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝

在審

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• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112514888A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設計）人: 周自豪;強斌;廉云飛
• 申請（專利權）人: 江蘇拓弘康恒醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 南京佰騰智信知識產權代理事務所(普通合伙) 32509
• 代理人: 胡麗華

本發(fā)明涉及生物細胞技術領域，尤其為一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，包括以下步驟：首先將臍帶組織進行剪開和鋪開，然后使用消毒液對臍帶組織的表面進行清理；對臍帶組織進行剪碎處理，然后對剪碎之后的臍帶組織內加入胰酶和EDTA進行消化處理；對酶解消化后的細胞進行離心處理然后在完全培養(yǎng)基重選后，進行密度傳代；對液體進行離心處理；對離心得到的上清中進行加入二甲基亞砜，然后進行混合處理，再轉入液氮中進行長期的保存處理，本發(fā)明中，通過上述技術工藝，不僅可以有效的避免牛血清的使用，從而盡可能少引入異源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高臍帶間充質干細胞的凍存保護液的質量。

技術領域

本發(fā)明涉及生物細胞技術領域，具體為一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝。

背景技術

間充質干細胞是來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層的成體干細胞，具有高度自我更新和多向分化潛能，存在于骨髓、脂肪等多種結締組織和器官間質中。間充質干細胞因其組織工程、造血干細胞移植以及基因治療領域的巨大潛力成為干細胞領域的研究熱點。臍帶來源的間充質干細胞具有非常高的分化潛能，可以定向誘導分化為骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經等多個組織，并且免疫原性低，取材方便，倫理學爭議小，相比于骨髓等其他來源的間充質干細胞，具有更加廣泛的應用前景。間充質干細胞具有可以大量擴增的特點，人臍帶間充質干細胞過度傳代會出現明顯的衰老和凋亡，長期體外培養(yǎng)會導致多分化潛能降低，黏附能力下降，細胞凋亡率增加，而且克羅恩病會導致人員發(fā)成腸萎等現象，而間充質干細胞的研究和開發(fā)使用可以提供了治療腸萎的新療法，因此，臍帶間充質干細胞也越來越多地被用于治療克羅恩病等，而對臍帶間充質干細胞冷凍保存使其保持良好的分化潛能是臍帶間充質干細胞研究和臨床應用的重要環(huán)節(jié)，因此，針對上述問題提出一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種用于臍帶間充質干細胞的凍存保護液制備工藝，包括以下步驟：

步驟一：清洗處理：首先使用消毒后的手術剪刀將臍帶組織進行剪開和鋪開，并且對鋪開后的臍帶組織進行固定處理，然后使用消毒液對臍帶組織的表面進行清理，清理時，使用棉球蘸消毒液對臍帶表面進行反復消毒清理，消毒清理的次數為3-5次，然后使用細胞前處理清洗緩沖液對臍帶組織進行清洗處理，清洗時，使用棉球蘸緩沖液進行反復清洗，清洗的次數為3-5次，從而有效的降低臍帶組織上紅細胞的比例，然后對臍帶組織進行收集待用；

步驟二：消化處理：然后對步驟一中得到的臍帶組織進行剪碎處理，剪碎處理時，控制臍帶組織剪碎的大小，使得單塊的臍帶組織的上端面面積控制在0.08cm²-0.2cm²，然后對剪碎之后的臍帶組織內加入胰酶和EDTA進行消化處理，消化處理時，使得胰酶和EDTA完全浸沒臍帶組織，并且在消化處理時，進行反復翻動臍帶組織，然后在消化處理之后去除臍帶組織，然后在酶解液中加入間充質干細胞培養(yǎng)基，從而終止消化，最后清洗酶解之后得到的細胞，最終獲得細胞懸液；

步驟三：細胞培養(yǎng)：對步驟二中得到的酶解消化后的細胞進行離心處理，在離心處理時，采用5000rpm-8000rpm的轉速進行離心處理，保證細胞的破裂，然后在完全培養(yǎng)基重選后，進行密度傳代，細胞連續(xù)生長24h-72h；

步驟四：離心取上清：對步驟三中得到的液體進行離心處理，在離心處理時，采用1500rpm-1800rpm的轉速進行離心處理，離心處理的時間為10-15分鐘，然后進行取上清備用；

步驟五：冷凍處理：對步驟四中得到的上清中進行加入二甲基亞砜，然后進行混合處理，在混合處理后，然后進行低溫過夜保存，最后再轉入液氮中進行長期的保存處理。