[發(fā)明專利]一種利用多重DPO-RT-PCR檢測南方菜豆花葉病毒及煙草環(huán)斑病毒的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011397569.8
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112280905B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發(fā)明（設計）人: 袁俊杰;龍陽;劉芳;李冠斯;魏霜;馬新華;盧乃會;楊卓瑜;陳文
• 申請（專利權）人: 湛江海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/94
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 黃華蓮;郝傳鑫

本發(fā)明涉及病毒檢測領域，尤其涉及一種利用多重DPO?RT?PCR檢測南方菜豆花葉病毒及煙草環(huán)斑病毒的方法。本發(fā)明建立的SBMV及TRSV的一步法雙重DPO?RT?PCR檢測方法具有特異性強、適用范圍廣的優(yōu)點，可用于南方菜豆花葉病毒及煙草環(huán)斑病毒的快速篩檢，也為植物病毒的多重檢測方法提供了一種新思路，具有較強的實用價值。本發(fā)明建立的SBMV及TRSV雙重DPO?PCR檢測方法，為口岸實驗室對其的快速篩查提供參考。

技術領域

本發(fā)明涉及病毒檢測領域，尤其涉及一種利用多重DPO-RT-PCR檢測南方菜豆花葉病毒及煙草環(huán)斑病毒的方法。

背景技術

我國是大豆主要進口國，具海關數據顯示，2019年全年共進口大豆8551.1萬噸，創(chuàng)歷史第二高峰。隨著大豆大量進口，其中攜帶的有害生物存在侵入我國的風險。南方菜豆花葉病毒(Southern?bean?mosaic?virus，SBMV)及煙草環(huán)斑病毒(Tobacco?ring?spotvirus，TRSV)屬于我國進境植物檢疫性有害生物，均存在通過侵染大豆傳入我國的風險。目前口岸主要使用DAS-ELISA和RT-PCR方法對兩種病毒進行檢測，時間長，通量低，因此建立高通量的病毒檢測方法對提高口岸檢測效率有重要意義。

雙啟動寡核苷酸引物(dual-priming?oligonucleotide，DPO)是一種新型PCR引物設計方法，具有特異性高，引物自身及引物間難形成二級結構，引物設計簡單等優(yōu)點。目前已經廣泛的應用于如大麗輪枝菌、黑白輪枝菌、向日葵白銹病菌、向日葵黑莖病菌、油菜莖基潰瘍病菌、番茄斑萎病毒等植物病害的檢測中。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用多重DPO-RT-PCR檢測南方菜豆花葉病毒及煙草環(huán)斑病毒的方法。

為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：提供一種利用多重DPO-RT-PCR檢測南方菜豆花葉病毒和/或煙草環(huán)斑病毒的試劑盒，所述試劑盒包括DPO-PCR引物對，所述DPO-PCR引物對的序列如下：

SBMV-DPOf：GTAGTGGTGCGTGTGCCAAIIIIIGTGTGGTCCAA；

SBMV-DPOr：CAAGGGCCTTGACCCTGCCGCIIIIIGGTAGTTTAAAG；

或

TRSV-DPOf：GTTACGTTGTTCTTTTACTCTCIIIIIATTTTAATTG；

TRSV-DPOr：ATACCGAACAACTTCATGTTCAGTIIIIITTAAAACGTCCAC；

其中，“I”表示次黃嘌呤。

作為本發(fā)明所述試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述DPO-PCR引物對在體系中的濃度為0.1～0.6μmol/L。

作為本發(fā)明所述試劑盒的優(yōu)選實施方式，所述DPO-PCR引物對在體系中的濃度為0.2μmol/L。

作為本發(fā)明所述試劑盒的優(yōu)選實施方式，還包括陽性標準品、陰性對照品、PCR預混液和無核酸酶水。

本發(fā)明還提供所述的試劑盒在檢測南方菜豆花葉病毒和/或煙草環(huán)斑病毒中的應用。

作為本發(fā)明所述應用的優(yōu)選實施方式，所述檢測過程中退火溫度為45～65℃。

作為本發(fā)明所述應用的優(yōu)選實施方式，所述檢測反應條件為42℃30min；95℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min。

作為本發(fā)明所述應用的優(yōu)選實施方式，所述檢測包括將PCR擴增產物經2％瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統中成像分析的步驟。

本發(fā)明的有益效果：