[發明專利]基于SNP分子標記鑒定馬蘇金槍魚的引物、方法和試劑盒

有效

• 申請號: 202011395840.4
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112592982B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 王聯珠;郭瑩瑩;姚琳;江艷華;曲夢;李娜;李風鈴;譚志軍;盧立娜;柳淑芳
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京智繪未來專利代理事務所(普通合伙) 11689
• 代理人: 郭紅燕

本發明提供基于SNP分子標記鑒定馬蘇金槍魚的成套引物，其包括基于馬蘇金槍魚的物種特異性SNP分子標記而設計的一對PCR擴增引物和一條探針。該SNP分子標記包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C堿基，一對PCR擴增引物中上游引物的序列是或包含5’?CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT?3’，下游引物的序列是或包含5’?GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT?3’，探針是序列為5’?TTTCATTCTGCCACTGTG?3’的普通探針或者序列為5’?cattctg(C)ca?3’的循環探針，探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

技術領域

本發明屬于水產品物種鑒別、檢測的技術領域，具體涉及基于物種特異性的SNP分子標記鑒定馬蘇金槍魚的引物、方法和試劑盒。

背景技術

金槍魚具有很高的的經濟價值，是世界上高檔的水產品之一。在國內金槍魚的主要銷售形式為生魚片、壽司和罐頭，金槍魚及制品的銷售量從幾噸上升到了幾萬噸，高檔金槍魚甚至占市場份額的60％以上。不同品種金槍魚價格差異很大，加之其體型較大，多采用去頭去皮后分割銷售的方式，使得一般消費者很難區分這種缺失了典型外形特征的產品，導致金槍魚市場上標簽錯亂和以次充好的問題尤為嚴重。

馬蘇金槍魚被世界自然保護聯盟紅色名錄列為極度瀕危等級，雖然已經開始進行人工養殖，但其自然群體資源已處于過度捕撈狀態。馬蘇金槍魚是一個重要的商業物種，該物種在生魚片市場非常珍貴，壽司店常用高品質的含脂肪的該種魚作高檔壽司。

鮮活的馬蘇金槍魚具有鮮明和完整的外部形態學特征，可采用形態學鑒定方法進行鑒別，但是針對生魚片或者經深加工工藝處理過的魚類產品如罐頭等，原本的形態學特征和蛋白質伴隨加工過程的進行而逐漸流失或變性，由于缺乏外部形態學特征，不易鑒定其真偽，不法商家以次充好，甚至通過染色的方式，以低價值的其他金槍魚生魚片冒充高價值的馬蘇金槍魚，獲取暴利，擾亂了市場秩序，破壞了商業誠信，損害了消費者利益，馬蘇金槍魚鑒別方法成為金槍魚行業的迫切需求。另一方面，國際組織開展非法捕撈的打擊活動、瀕危物種的保護活動，也需要快速、準確鑒別馬蘇金槍魚物種。因此，快速、準確地鑒定馬蘇金槍魚及其制品的試劑和方法已成為國內外研究的熱點。

發明內容

本發明的目的一方面在于提供基于SNP分子標記用于鑒定馬蘇金槍魚的成套引物，所述成套引物包括基于所述SNP分子標記而設計的一對PCR擴增引物和一條探針。

優選地，所述SNP分子標記包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C堿基。

優選地，所述一對擴增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探針的序列是5’-TTTCATTCTGCCACTGTG-3’，5’端標記有熒光報告基團6-FAM，3’端標記有熒光淬滅基團MGB(Minor Groove Binder，小溝結合物)。

優選地，所述一對擴增引物中的上游引物的序列是或包含5’-CCACAACCTCTGAGTCTGAACCT-3’，下游引物的序列是或包含5’-GCAAAGGCTGATAGTAAACAACAAAT-3’，所述探針是循環探針，其序列是5’-cattctg(C)ca)-3’，5’端標記有熒光報告基團6-FAM，3’端標記有熒光淬滅基團Eclipse。

另一方面，本發明還提供一種基于SNP分子標記鑒定馬蘇金槍魚的方法，所述SNP分子標記包括位于SEQ ID No.1所示序列中第255位的C堿基，所述方法包括以下步驟：(I)基于所述SNP分子標記設計一對PCR擴增引物和一條探針；(II)從待鑒定對象的肌肉組織中提取DNA；(III)利用所述一對PCR擴增引物和所述探針，以步驟(II)中所提取的DNA為模板進行實時熒光PCR反應。