[發明專利]一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法

有效

• 申請號: 202011395535.5
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112458209B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 夏子豪;高新然;安夢楠;吳元華;王志華;郝凱強;羅雪琮
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/94
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于植物病毒檢測方法領域，特別涉及一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，包括樣品的核酸提取，反轉錄，RPA反應特異性檢測，電泳，判斷樣品是否攜帶MCMV和SCMV兩種病毒。本發明的方法特異性良好，靈敏度較高，反應時間短。

技術領域

本發明屬于植物病毒檢測方法領域，特別涉及一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法。

背景技術

甘蔗花葉病毒(Sugarcane?mosaic?virus,SCMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，主要由蚜蟲以非持久性方式傳播，也可汁液和種子傳播。SCMV侵染植物后在葉片表面形成花葉癥狀，也可造成植株矮化，引起玉米矮花葉病。玉米矮花葉病屬于世界性病毒病害，其中甘蔗花葉病毒北京分離物(SCMV-BJ)是引起我國北方玉米產區玉米矮花葉病的優勢株系。

玉米褪綠斑駁病毒(Maize?chlorotic?mottle?virus,MCMV)屬于番茄叢矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪綠斑駁病毒屬(Machlomovirus)，主要由汁液、介體甲蟲、薊馬傳播，也可種傳。MCMV侵染植物后可造成寄主植物葉片褪綠、斑駁，也可造成壞死斑點、卷曲、葉尖壞死、矮化等癥狀。MCMV是我國重要的檢疫性有害生物。在我國，MCMV和SCMV復合侵染引起玉米致死性壞死病(Maize?lethal?necrosis?disease,MLND)，造成玉米產量損失慘重。

目前，檢測SCMV的方法主要有血清學檢測、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)等；MCMV的檢測方法主要有血清學檢測、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)、逆轉錄重組酶聚合酶擴增技術(RT-RPA)等。血清學檢測方法是一種用于常規檢測的有效方法，但是該方法需要特異性的抗體，制作抗體過程繁瑣、費時較長。利用分子生物學建立的RT-PCR、RT-LAMP方法檢測結果更為快速、靈敏，但所需要的檢測設備和探針試劑成本較高。

RPA(Recombinase?polymerase?amplification)是一種新型的DNA等溫擴增技術，可以靈敏、特異、快速地擴增模板DNA，也可現場檢測植物病毒，目前尚未發現利用RPA技術同時檢測兩種植物病毒的報道。

發明內容

本發明提供的一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，特異性良好，靈敏度較高，反應時間短，使得整個檢測方法高效、便捷、省時。

本發明提供了一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，包括以下步驟：

S1，提取樣品的總RNA；

S2，對S1提取的總RNA進行反轉錄；

S3，RPA反應特異性檢測：用甘蔗花葉病毒和玉米褪綠斑駁病毒的特異性RPA引物進行RPA擴增；

所述甘蔗花葉病毒的特異性RPA引物為SCMV-F，SCMV-R，玉米褪綠斑駁病毒的特異性RPA引物為MCMV-F和MCMV-R；

SCMV-F的引物序列如SEQ?ID?NO.1所示；

5’-CAAGATATATCAAACACTAGAGCAACTAAG-3’

SCMV-R的引物序列如SEQ?ID?NO.2所示；

5’-GAAGTCATTTCATAGAAATCGAAAGCATAC-3’

MCMV-F的引物序列如SEQ?ID?NO.3所示；

5’-CTCTCCGATTACATGTTATCAATACCCACTG-3’

MCMV-R的引物序列如SEQ?ID?NO.4所示。