[發明專利]一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法

有效

• 申請號: 202011395535.5
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112458209B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 夏子豪;高新然;安夢楠;吳元華;王志華;郝凱強;羅雪琮
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/94
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，提取樣品的總RNA；

S2，對S1提取的總RNA進行反轉錄；

S3，RPA反應特異性檢測：用甘蔗花葉病毒和玉米褪綠斑駁病毒的特異性RPA引物進行RPA擴增；

所述甘蔗花葉病毒的特異性RPA引物為SCMV-F，SCMV-R，玉米褪綠斑駁病毒的特異性RPA引物為MCMV-F和MCMV-R；

SCMV-F的引物序列如SEQ?ID?NO.?1所示；

SCMV-R的引物序列如SEQ?ID?NO.?2所示；

MCMV-F的引物序列如SEQ?ID?NO.?3所示；

MCMV-R的引物序列如SEQ?ID?NO.?4所示；

S4，對RPA產物純化后進行電泳檢測；

S5，判斷樣品是否攜帶MCMV和SCMV兩種病毒，若攜帶則檢測到玉米致死性壞死??；

具體判斷標準為：電泳結果中，若只檢測到大小為206bp的一條條帶，則說明檢測到玉米褪綠斑駁病毒；

若只檢測到大小為388bp的一條條帶，則說明檢測到甘蔗花葉病毒；

若同時檢測到206bp和388bp的兩條條帶，則說明檢測到玉米褪綠斑駁病毒和甘蔗花葉病毒兩種病毒，即檢測到玉米致死性壞死??；

若無目標條帶，則未檢出以上兩種病毒。

2.如權利要求1所述的玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，其特征在于，S3中，所述RPA擴增具體為：向含有凍干酶粉的0.2?ml?TwistAmp?反應管中加入再水化緩沖液?29.?5μl，去離子水6.4?μl，上、下游引物各2.4?μl，模板cDNA?各1?μl，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl，充分混勻后于38℃的水浴鍋中反應30min，然后將RPA產物進行純化。

3.如權利要求2所述的玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，其特征在于，引物終濃度為0.4?μmol?/L，醋酸鎂溶液濃度為280?mmol?/L。

4.如權利要求1所述的玉米致死性壞死病多重RPA檢測方法，其特征在于，S5中，甘蔗花葉病毒擴增條帶為388bp，玉米褪綠斑駁病毒擴增條帶為206bp。