[發明專利]煙臺黑豬SLA-2基因真核表達細胞系的構建及表達

在審

• 申請號: 202011395245.0
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112480238A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 高鳳山;胡曉
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

1.煙臺黑豬SLA-2基因真核表達細胞系的構建及表達，其特征在于，該方法的步驟如下：

(1)引物的設計與合成；

(2)目的基因PCR擴增與DNA片段回收；

(3)煙臺黑豬SLA-2編碼區基因TA克隆載體的構建；

(4)煙臺黑豬SLA-2編碼區基因真核表達載體的構建；

(5)嘌呤霉素終濃度測定；

(6)慢病毒包裝；

(7)慢病毒感染sT2細胞及抗性篩選；

(8)Western Blotting檢測外源基因的表達；

(9)統計學處理。

2.根據權利要求1所述的煙臺黑豬SLA-2基因真核表達細胞系的構建及表達，其特征在于，步驟(1)中選擇的限制性內切酶為：Xba I和Not I，在上下游引物的5’端分別添加酶切位點和保護性堿基。

3.根據權利要求1所述的煙臺黑豬SLA-2基因真核表達細胞系的構建及表達，其特征在于，步驟(2)的詳細步驟如下：以SLA-2-YT/pMD18-T質粒為模板，以pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R作引物，用Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系統進行PCR，擴增SLA-2-YT編碼區基因序列，PCR反應體系為：5×SF buffer，5μL；dNTP Mix，1μL；SLA-2-YT/pMD18-T全基因質粒，4μL；SLA-2-YT-F，1μL；SLA-2-YT-R，1μL；Super-Fidelity DNAPolymerase，0.5μL；超純水補足至25μL；PCR擴增程序為：95℃，預變性3min；95℃變性30s，66℃退火30s；72℃延伸1min，擴增35個循環；72℃徹底延伸10min；PCR擴增產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀成像；確認目的條帶的大小正確后，用DNA凝膠回收試劑盒進行膠回收；由于用DNA聚合酶Super-Fidelity DNA Polymerase進行PCR擴增的目的片段末端平滑化不易與pMD19-T Simple Vector連接，因此需要在回收后的PCR產物DNA雙鏈的3’端分別添加Poly A尾，使其轉變為粘性末端，反應液體系如下：10×Ex Taqbuffer,5μL；dATP，1μL；PCR回收產物，35μL；Ex Taq酶，1μL，超純水補足至50μL；條件為：72℃水浴15min；添加PolyA尾后的PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統成像，目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒進行膠回收并保存回收產物。

4.根據權利要求1所述的煙臺黑豬SLA-2基因真核表達細胞系的構建及表達，其特征在于，步驟(3)的詳細步驟如下：將回收的目的條帶與pMD19-T Simple Vector連接，反應體系為：pMD 19-T Simple Vector，0.5μL；加PolyA尾回收產物，9.5μL；Solution I,10μL；條件為：16℃低溫水浴2小時。將連接產物轉化至Escherichia coli.Top10感受態細胞，涂平板，37℃過夜培養，挑取生長良好的重組單克隆菌落擴大培養后進行質粒提取，將提取的重組質粒用Not I/Xba I進行雙酶切驗證，選擇初步鑒定正確的陽性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司測序；通過雙向DNA測序確認插入序列的完整性后，將測序正確的陽性克隆菌株命名為SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌種供后期實驗使用。