[發明專利]一種CHO-DHFR+細胞株及其應用

有效

• 申請號: 202011393700.3
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112501126B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 喬磊;楊盼盼;鄭彬彬;王建剛;吳明遠
• 申請（專利權）人: 康立泰生物醫藥（青島）有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C07K14/54;C12N15/85
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 劉鑫;韓蕾

本發明提供了一種CHO?DHFR+細胞株及其應用。該細胞株的保藏編號為CCTCC?NO：C2019264。本發明的CHO?DHFR+細胞株能夠無血清懸浮高密度培養，培養過程中僅需在培養體系中添加少量谷氨酰胺，即可維持細胞正常生長和生產，降低了谷氨酰胺代謝產生的有毒廢物NHsubgt;4/subgt;supgt;+/supgt;的積累，細胞倍增水平高、細胞活力高。采用含IL?10基因序列的pcDNA3.1?β重組質粒載體轉染該CHO?DHFR+細胞株，能夠獲得表達重組IL?10的工程細胞株，通過含有G418的CD?OptiCHO培養基培養，高效表達重組IL?10蛋白，重組IL?10蛋白的瞬轉表達量大于0.96mg/L，有較好的商業應用價值。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種CHO-DHFR+細胞株及其應用。

背景技術

中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是生產蛋白類藥物的首選宿主細胞，因為與其他系統相比，CHO細胞具有以下優點：①CHO細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能，因此其表達的蛋白質的生物學活性更接近于天然蛋白；②CHO細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強，可根據培養要求選擇可貼壁培養或懸浮培養的方式；③整合外源基因后的細胞穩定，重組基因能高效擴增和表達；④表達的目的蛋白可由細胞內運輸到細胞外，并且CHO細胞只表達少量的內源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市場上一半以上最為暢銷的生物制劑是由CHO細胞產生的。如，阿達木單抗(Humira)、貝伐單抗(Avastin)和利妥昔單抗(Rituxan)?？梢哉f，CHO細胞對現代生物藥工業發展做出了不可磨滅的貢獻。

目前CHO細胞在工業上的篩選類型有：

①二氫葉酸還原酶營養缺陷突變細胞株(代表細胞CHO-DG44(Thermo),CHO-DUXB11(Chasin?Lab))：DHFR是dihydrofolate?reductase的縮寫。該細胞系為DHFR基因缺陷型。DHFR用于催化二氫葉酸還原成四氫葉酸。突變體不能合成四氫葉酸。因而不能在缺乏次黃嘌呤(Hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)的培養基上生長。只有導入DHFR或者培養基中添加次黃嘌呤和胸腺嘧啶才能生長。因此DHFR可作為篩選標記或報告基因。

CHO-DG44在1983年誕生。CHO-DG44具有DHFR雙缺陷，被敲除了2個位點。DG44可用于篩選，在工業使用也最廣泛。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的拮抗劑，可使DHFR大量表達，因此可使細胞外源基因的拷貝數擴增并得到較高表達。

DHFR基因擴增系統是最常用的基因擴增選擇系統。但該系統也存在一些不足，如該方法需要較高濃度的MTX，而外源基因表達水平不高，增加了篩選細胞克隆的工作量等。

②谷氨酰胺合成酶(GS)擴增系統(代表細胞CHOK1SV-KO(Lonza)，CHOZN(Merk)，CHO-S(Thermo))是新近發展的更有效的系統，具有更高的擴增效率，速度快，穩定性好，產量高等優勢，同時該系統由于不需要額外谷氨酰胺的添加導致了更低的代謝廢物氨的含量，更好的細胞活率，更有利于后續的工業化生產，但使用成本較高。

CN107760650A公開了一種經改造的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及其用途，所述經改造的CHO細胞能夠在無血清、懸浮培養的條件下穩定且高密度生長，并且優選地不表達功能性的谷氨酰胺合成酶和巖藻糖基轉移酶8。該方法敲除了CHO細胞的內源性GS基因，因此，后續培養過程中需要在培養基中補加較大量的谷氨酰胺，而谷氨酰胺不穩定，4℃下放置7天即可分解約50％，而且降解產物不利于細胞生長。

發明內容