[發明專利]能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因及其應用

在審

• 申請號: 202011391351.1
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN113637677A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 宋任濤;祁巍巍;霍真真;谷雅靜;王敏芝;陳璇
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 于慧

本發明涉及一種能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因及其應用。該靶點基因為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意一種或兩種。本發明運用改造后的CRISPR/Cas9載體與同源比對后所選取的α醇溶蛋白19kD與22kD各基因簇上的20bp靶標分別進行連接，通過農桿菌介導的玉米幼胚轉化實驗獲得了α醇溶蛋白基因編輯材料，通過對后代樣本進行表型觀察，發現一些轉基因事件的籽粒有粉質不透明的胚乳,以及19kD和22kD醇溶蛋白含量的顯著下降。同時也獲得了α醇溶蛋白含量顯著下降的自交系材料。而醇溶蛋白的下降可提升玉米籽粒中賴氨酸和色氨酸等必需氨基酸的含量，從而提高玉米的營養品質。

技術領域

本發明涉及一種能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因及其應用。

技術背景

玉米(Zea mays)是世界上產量最高的禾本科作物之一。除了作為糧食外，玉米還是禽畜重要的飼料來源，也是重要的工業原料。因此玉米對于社會的進步起到了重要的作用。隨著人們生活水平的不斷提高，對于所攝取食物的品質也提出了更高的要求。因而玉米的蛋白質品質是一個重要的研究性狀。

醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要儲藏蛋白，占總蛋白的60％以上，然而其賴氨酸和色氨酸等必需氨基酸含量極低，導致傳統的玉米籽粒中氨基酸組成不均衡。在籽粒主要農藝性狀不改變的條件下，降低籽粒中醇溶蛋白的比例能夠顯著地提高籽粒的蛋白質品質。

玉米籽粒中醇溶蛋白由4個基因家族編碼，分為α-zein(Mr 19kDa、22kDa)，β-zein(Mr 14kDa)，γ-zein(Mr 16kDa、27kDa)，δ-zein(Mr 10kDa、15kDa)。其中，α醇溶蛋白和γ醇溶蛋白的含量占比較高，分別占了醇溶蛋白的總含量的60-70％、20-25％。α醇溶蛋白是最早被描述的儲藏蛋白之一。實驗研究表明α醇溶蛋白是由幾個大的多基因家族編碼，通過利用序列同源及基于DNA的Southern blot實驗得到的拷貝數，將α醇溶蛋白分為Z1A、Z1B、Z1C和Z1D四個亞家族。根據分子量的不同，其中Z1A、Z1B、Z1D屬于19kD蛋白家族，而Z1C屬于22kD蛋白家族。

盡管α醇溶蛋白基因家族的大小和復雜度在各個自交系中有明顯的差異，但是基因序列卻高度保守。在19kD基因家族內部，Z1A、Z1B、Z1D各亞家族成員之間的同源度在75％到95％之間，而19kD和22kD基因家族之間的同源度也有60％-65％。根據其同源性，利用CRISPR/Cas9技術構建靶向19kD和22kDα醇溶蛋白基因的轉化載體，通過農桿菌介導的玉米幼胚轉化技術來獲得轉基因后代，進而分析一系列生理生化表現及細胞學變化，以期獲得高賴氨酸的轉基因玉米果穗。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因。

本發明的目的之二在于提供含有該靶點基因的表達載體。

本發明的目的之三在于提供該表達載體的構建方法。

本發明的目的之四在于提供該基因能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因在降低玉米中α醇溶蛋白含量，提高賴氨酸含量中的應用。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因，其特征在于該靶點基因為SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意一種或兩種。

上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因，其特征在于該靶點基因為SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列中任意兩種。

上述的能降低玉米中α醇溶蛋白的靶點基因，其特征在于該靶點基因為SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸序列或SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸序列。