[發明專利]一種用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011390244.7
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112574030B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 袁智勤;張凱;田明策
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C07C67/08
• 分類號: C07C67/08;C07C69/16;C07C271/44;C07C69/76;C07C269/00;C07F9/12;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司 11108
• 代理人: 王宇

本發明公開了一種用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針及其制備方法和應用。本發明利用分子內氫鍵的斷裂/生成所引起的熒光發射的變化，通過對單苯環分子上的羥基基團進行化學修飾，得到了具有良好水溶性的單苯環熒光探針。熒光探針與酶反應后，釋放出羥基并與相鄰基團生成分子內氫鍵，從而產生熒光發射紅移。本發明制備的單苯環熒光探針具有高選擇性，高穩定性，高靈敏度，較低的檢出限和良好的生物相容性，可用于內源性酶的檢測。此外，本發明設計的單苯環熒光探針，制備方法簡單，原料廉價易得，成本低，制備的產品產率高，適合大規模推廣應用。

技術領域

本發明屬于熒光探針技術領域，特別涉及一種用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針及其制備方法和應用。

背景技術

細胞代謝的調控是生命活動的基礎，其中大部分都是由酶來催化控制的。生物酶通過調節細胞內生化反應的速率，控制多種生理過程的進行，在維持正常的細胞生理活動中起著關鍵作用。如果沒有酶的存在，許多重要的生化反應將以無法維持生命的速率進行。研究表明，某些酶的活性異常與一些重大疾病如癌癥等的發生密切相關，常常被作為相關疾病診斷和藥物發現的生物標志物。因此，發展快速、靈敏、準確的檢測生物酶活性的分析方法，對于疾病的早期診斷和精確治療具有重要的意義?；谟袡C小分子熒光探針具有高靈敏度、高選擇性、快速的響應時間以及對生物無破壞性等優點，在生物酶的檢測中受到了廣泛關注。

目前報道的有機小分子熒光探針多是一些多苯環的有機小分子熒光探針，與多苯環分子相比，具有易制備，高穩定性和低成本等優點的單苯環有機小分子卻由于其熒光發射大都在紫外區而不適用于熒光傳感。但單苯環分子具有的較小尺寸可能會與目標(如：蛋白質和DNA)結合的更加靈敏。換句話說，單苯環分子可能作為一類新型有機探針，對分析物的檢測提供新的途徑。因此，設計和合成具有可見或近紅外熒光發射的單苯環分子至關重要。

發明內容

本發明利用分子內氫鍵來調控單苯環分子的熒光性質，從而提供一種用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針及其制備方法，并且將該類單苯環熒光探針成功的應用于HeLa細胞中堿性磷酸酶的生物成像，探針光穩定性好，在活細胞成像中光信號穩定。

本發明所述的用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針的結構式如下：

本發明所述的用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針的制備方法為：

(1)將4,6-二羥基間苯二甲酸或2,5-二羥基對苯二甲酸分別進行羧基保護反應；

(2)將步驟(1)得到的羧基保護產物分別進行磷酸化反應、酰胺化反應、酯化反應；

(3)將步驟(2)得到的產物分別進行解保護反應，相應得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)所示的用于檢測生物酶的比率型單苯環熒光探針。

上述各步驟反應如下反應式所示：

步驟(1)所述的羧基保護反應的具體操作步驟為：向含有4,6-二羥基間苯二甲酸或2,5-二羥基對苯二甲酸的圓底燒瓶中加入無水DMF和NaHCO₃，室溫下攪拌10-30分鐘；然后加入芐基溴，55-60℃下攪拌反應2-8小時后用水淬滅反應，用DCM萃取有機化合物，合并有機層，用飽和鹽水洗滌，無水Na₂SO₄干燥，過濾，最后旋轉蒸發除去溶劑得到羧基保護產物；其中4,6-二羥基間苯二甲酸或2,5-二羥基對苯二甲酸、NaHCO₃和芐基溴的摩爾比為1:2-4:3-5。