[發(fā)明專利]分離檢測(cè)葉酸中葉酸及葉酸光學(xué)異構(gòu)體的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011390239.6
• 申請(qǐng)日: 2020-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN112649524B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周書榮;李冰潔;陳雯;杜帥;蘭昌云;劉闊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶華邦勝凱制藥有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 北京元本知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離檢測(cè)葉酸及其光學(xué)異構(gòu)體的方法，該方法采用的色譜柱是以硅膠表面共價(jià)鍵合O?9?(叔丁基氨基甲酰)奎寧為填料，采用有機(jī)溶劑、有機(jī)酸和三乙胺進(jìn)行梯度洗脫，將葉酸和/或葉酸光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行分離；流動(dòng)相流速為0.4～0.6ml/min；色譜柱柱溫為20～30℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為280±10nm；使用的稀釋劑為四氫呋喃、甲醇、水、醋酸、三乙胺的混合溶液，利用峰面積歸一化法測(cè)得葉酸及其光學(xué)異構(gòu)體的含量。該方法葉酸及其光學(xué)異構(gòu)體出峰時(shí)間快，20分鐘內(nèi)即可完成，峰型對(duì)稱，能將其從多種雜質(zhì)中分離出來，得到準(zhǔn)確的含量，方法簡(jiǎn)單、快速、有效。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC法分離檢測(cè)葉酸中葉酸及葉酸光學(xué)異構(gòu)體的方法。

背景技術(shù)

葉酸是一種水溶性維生素，分子式是C₁₉H₁₉N₇O₆,分子量441.40,化學(xué)名為N-[4-[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氫-6-蝶啶)甲氨基]苯甲?；鵠-L-谷氨酸。因綠葉中含量十分豐富而得名，又名喋酰谷氨酸。在自然界中有幾種存在形式，其母體化合物是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合而成，其結(jié)構(gòu)式如下：

葉酸呈黃色或橙黃薄片狀或針狀晶體，無臭無味，加熱至約250℃，色漸變深，最后成黑色膠狀物。不易溶于水和乙醇，易溶于酸性或堿性溶液。抗貧血藥，對(duì)正常紅細(xì)胞形成有促進(jìn)作用。在茶樹物質(zhì)代謝中，參與甲基的傳送。也參與體內(nèi)氨基酸及核酸合成，并與維生素B12共同促進(jìn)紅血球的生成。用于各種巨幼紅細(xì)胞性貧血，尤適用于孕婦及嬰兒巨幼紅細(xì)胞性貧血。但在制藥領(lǐng)域，制備葉酸時(shí)會(huì)出現(xiàn)多種雜質(zhì)，其中一種為葉酸的光學(xué)異構(gòu)體，化學(xué)名為(2R)-2-[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氫蝶啶-6-基)甲基]氨基]苯甲酰胺基]戊二酸，分子式為C₁₉H₁₉N₇O₆，分子量為441.40，結(jié)構(gòu)式為：

上述物質(zhì)為葉酸光學(xué)異構(gòu)體，性質(zhì)和結(jié)構(gòu)都存在相似，其分離難度更大，而目前也并沒有相關(guān)技術(shù)披露可以將其從眾多雜質(zhì)中進(jìn)行分離，所以分析葉酸光學(xué)異構(gòu)體仍是一個(gè)技術(shù)問題，對(duì)于相關(guān)藥物的分析存在阻礙。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明目的之一是提供一種利用高效液相色譜法將葉酸和/或葉酸光學(xué)異構(gòu)體從葉酸粗品中分離出來的方法，該方法可有效快速的將葉酸及其光學(xué)異構(gòu)體與相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分離。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

從葉酸及相關(guān)雜質(zhì)中分離葉酸和/或葉酸光學(xué)異構(gòu)體的方法，所述方法采用的色譜柱是以硅膠表面共價(jià)鍵合O-9-(叔丁基氨基甲酰)奎寧為填料，采用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B將所述葉酸和/或葉酸光學(xué)異構(gòu)體從所述葉酸及相關(guān)雜質(zhì)中進(jìn)行分離；所述流動(dòng)相A為有機(jī)溶液；所述流動(dòng)相B為有機(jī)酸和三乙胺的混合溶液；所述相關(guān)雜質(zhì)為雜質(zhì)A～I(xiàn)、雜質(zhì)SM1d、雜質(zhì)SM1k、葉酸光學(xué)異構(gòu)體中的一種或多種；所述葉酸和相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下：

雜質(zhì)I：EP標(biāo)準(zhǔn)中注明為未知結(jié)構(gòu)，但有關(guān)物質(zhì)中有檢出，無法得到標(biāo)準(zhǔn)品，在本方法中不在光學(xué)異構(gòu)體位置出峰，不干擾光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)檢測(cè)。

進(jìn)一步，所述流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為80～120:4～8。

進(jìn)一步，所述有機(jī)溶液為甲醇和乙腈的混合溶液，其體積比為40～60:40～60。

進(jìn)一步，所述流動(dòng)相B為醋酸和三乙胺的混合溶液，其體積比為2～4:2～4。

進(jìn)一步，所述流動(dòng)相流速為0.4～0.6ml/min。

進(jìn)一步，所述色譜柱柱溫為20～30℃。