[發(fā)明專利]一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011388141.7
• 申請(qǐng)日: 2020-12-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112481203A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉宇;李崴;郭康合;林冠妃;王岱桑;張萬(wàn)程;李秋宛;陳多峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南優(yōu)尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 葉似錦

1.一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)產(chǎn)婦篩查；

2)樣本采集；

3)樣本檢測(cè)；

4)樣本預(yù)處理；

5)細(xì)胞分離制備；

6)原代培養(yǎng)；

7)傳代培養(yǎng)；

8)細(xì)胞檢測(cè)；

9)細(xì)胞凍存；

10)建立可供檢索的細(xì)胞信息檔案；

11)編碼入庫(kù)并上傳細(xì)胞信息檔案。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟1)中產(chǎn)婦篩查為取5ml產(chǎn)婦外周血及5ml臍血進(jìn)行病原微生物檢測(cè)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟2)中樣本采集包括如下步驟：

1)在距臍帶兩端2-3cm處結(jié)扎；

2)剪下結(jié)扎好的臍帶置于裝有30-50ml儲(chǔ)存液的采集瓶中；

3)將去掉臍帶后的胎盤(pán)置于裝有400-600ml儲(chǔ)存液的采集盒中。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟4)中樣本預(yù)處理包括如下步驟：

1)將樣本在生理鹽水中洗凈殘血；

2)用75％醫(yī)用酒精消毒浸泡；

3)再用生理鹽水漂洗2-3次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟5)中的細(xì)胞分離制備，包括如下步驟：

1)將預(yù)處理后的新鮮胎盤(pán)胎兒面，光滑面朝上，以臍帶根部為中心劃十字切口，剝離羊膜；

2)將羊膜用生理鹽水清洗干凈，瀝干水分；

3)用眼科彎剪剪碎呈肉糜狀轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)；加入含有5-20倍體積的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍體積的生理鹽水終止消化，吹打混勻，離心機(jī)升9降9，1000-2500rpm，4℃離心3-10min洗滌，去除上清后再用生理鹽水離心洗滌兩次，離心機(jī)升9降9，1000-2500rpm，4℃離心3-10min；

4)剝離羊膜后，分離絨毛膜，將剝離的絨毛膜再次用生理鹽水清洗干凈，瀝干水分；

5)用眼科彎剪剪碎呈肉糜狀轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)；加入含有5-20倍體積的0.05％-0.25％的酶消化10-120min后，加入5-10倍體積的生理鹽水終止消化，吹打混勻，按照1：(1-3)的比例加入到分裝好的淋巴細(xì)胞分離液中，離心機(jī)升1降1，1000-2000rpm，4℃離心20分鐘，取中間白膜層及以上細(xì)胞組織，再用生理鹽水離心洗滌兩次，離心機(jī)升9降9，1000-2500rpm，4℃離心3-10min；

6)將預(yù)處理后的臍帶樣本用手術(shù)剪剪成小段，再次用生理鹽水清洗干凈，剝?nèi)∪A通氏膠，用眼科彎剪剪碎呈肉糜狀。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟6)中原代培養(yǎng)包括如下步驟：

1)用間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)液重懸處理好的組織塊或細(xì)胞后接種至培養(yǎng)皿中，間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)液沒(méi)過(guò)細(xì)胞或組織塊2-5mm；

2)放置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天觀察一次，每隔5-7天根據(jù)細(xì)胞爬出情況補(bǔ)液或者換液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種圍產(chǎn)期間充質(zhì)干細(xì)胞種子庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟7)中傳代培養(yǎng)，包括如下步驟：

1)去除培養(yǎng)液，加入適量生理鹽水清洗1-3次，徹底去除殘留的組織塊；

2)加入1-5ml干細(xì)胞溫和酶干細(xì)胞溫和酶或胰酶室溫消化1-5min后，加入5倍體積生理鹽水終止消化；

3)收集細(xì)胞懸液1200-1700rpm離心3-15min棄上清液，所得細(xì)胞沉淀記為P0代細(xì)胞；

4)將P0代細(xì)胞接種至含20-25ml無(wú)血清完全培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿中，放入CO₂濃度5％，溫度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)；

5)待細(xì)胞增殖融合度達(dá)到85-95％后，按照上述處理步驟進(jìn)行消化收集得到P1代細(xì)胞，即為種子細(xì)胞。