[發明專利]一種廣譜熒光底物及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011387973.7
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112457250A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 葛廣波;周啟航;張鳳;涂東珠
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: C07D221/14
• 分類號: C07D221/14;C09K11/06;C12Q1/48;G01N21/64
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 周瓊

1.一種廣譜熒光底物，其特征在于：該廣譜熒光底物為具有如下結構通式(Ⅰ)的鹵代苯乙基-4-羥基1,8-萘酰亞胺衍生物中的一種：

其中，R₁選自F、Cl、Br或CF₃中的一種。

2.一種如權利要求1所述的廣譜熒光底物的制備方法，其特征在于步驟如下：

⑴將4-溴-1、8-萘酸酐和苯乙胺衍生物在乙醇中溶解混勻，反應并回流8小時后冷卻至室溫，倒入冰水中，分離出沉淀物，用水洗滌、干燥；

其中，4-溴-1、8-萘酸酐和苯乙胺衍生物的摩爾比為：1∶1.2；

其中，步驟⑴所述的苯乙胺衍生物為對氟苯乙胺、對溴苯乙胺、對氯苯乙胺和對三氟甲基苯乙胺中的一種；

⑵將步驟⑴所得產物和碳酸鉀在甲醇中混合回流10小時，冷卻至室溫后，加入濃鹽酸將pH值調節至1-2，過濾沉淀物，用水洗滌并干燥；

其中，步驟⑴所得產物和碳酸鉀的摩爾比為：1∶9；

⑶將步驟⑵所得產物和吡啶鹽酸鹽溶解在環丁砜中，加熱到200℃，反應8小時后冷卻，將混合物倒入水中，分離出沉淀物，用水洗滌，干燥即得所述廣譜熒光底物；

其中，步驟⑵所得產物和吡啶鹽酸鹽的摩爾比為：1∶20。

3.一種如權利要求1所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟如下：

(1)將三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液與MgCl₂，目標UGT酶，廣譜熒光底物溶液、抑制劑混合,反應溫度為20-60℃,pH值在5-10，預孵育3-5分鐘；

(2)將不同濃度的抑制劑與步驟(1)所得的混合溶液混勻，設置空白對照組，在37℃孵育3-5分鐘；

(3)在步驟(2)所得的混合溶液中加入尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，反應10-60分鐘；

(4)在步驟(3)所得的混合溶液中加入冰乙腈，在離心機上以20,000×g，4℃的條件下離心20分鐘，反應液離心沉淀蛋白后，用過液相-熒光檢測系統定量分析，熒光檢測條件為：激發波長分別為450nm，360nm；發射波長分別為560nm,450nm；

(5)定量測定反應時間內葡萄糖醛酸產物的生成速率并計算加入待測抑制劑的反應速率相對于空白對照組反應速率的百分數作為抑制活性評估標準。

4.一種如權利要求3所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟(1)中三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的pH＝7.4，目標UGT酶為人肝微粒體，步驟(2)中的抑制劑為尼羅替尼。

5.一種如權利要求4所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟(1)中廣譜熒光底物濃度為1/10-1K_m，反應溫度為37℃，pH為7.4。

6.一種如權利要求3所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟(4)中檢測條件以十八烷基甲硅烷基柱為固定相，以0.2％甲酸水和乙腈為流動相，0-1min，80％甲酸水，1-2min，80％-60％甲酸水；2-6min，60％-20％甲酸水；6-6.5min，20％甲酸水；6.5-7.5min，20％-80％甲酸水。

7.一種如權利要求1所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟如下：

(1)將三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液與MgCl₂，目標UGT酶，廣譜熒光底物溶液以及抑制劑在96或384酶標儀孔板上混合,反應溫度介于20-60℃之間,孵育體系pH介于5-10之間；

(2)預孵育，將不同濃度的抑制劑與步驟(1)所得混合溶液混勻，并設置空白對照組)，37℃下孵育3-5min；

(3)在步驟(2)所得的混合溶液中加入尿苷二磷酸葡萄糖醛酸后放入酶標儀，反應10-60分鐘；

(4)用酶標儀進行實時定量分析檢測，熒光檢測條件為：激發波長分別為450nm，360nm；發射波長分別為560nm,450nm；

(5)定量測定反應時間內葡萄糖醛酸產物的生成速率并計算加入抑制劑組的反應速率相對于空白對照組反應速率的百分數作為抑制活性評估標準。

8.一種如權利要求7所述的廣譜熒光底物的應用，其特征在于步驟(1)中廣譜熒光底物濃度為1/10-1K_m，抑制劑為穗花杉雙黃酮，反應溫度為37℃，pH為7.4。