[發(fā)明專利]一種來(lái)源于枸杞的糖苷酶及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011386939.8
• 申請(qǐng)日: 2020-12-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112695023B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷;賈紅華;齊雪蓮;邵俊瀾;余杰;嚴(yán)明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/26
• 分類號(hào): C12N9/26;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/14;C12P19/60;C12R1/84
• 代理公司: 南京新慧恒誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32424
• 代理人: 王月霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于枸杞的糖苷酶及其應(yīng)用，所述糖苷酶是經(jīng)過(guò)分析對(duì)比整合得到的如SEQ No.1所示氨基酸序列的α?葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，該酶能夠?qū)?AA轉(zhuǎn)化為單一的AA?2G，無(wú)副產(chǎn)物生成。本發(fā)明所述的α?糖苷酶可工業(yè)應(yīng)用，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單且時(shí)間短，并且產(chǎn)物單一易于純化。本發(fā)明的α?糖苷酶和使用該酶生產(chǎn)AA?2G的方法可以為酶法生成AA?2G提供新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種枸杞來(lái)源的α-糖苷酶及其在生產(chǎn)2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

α-糖苷酶即α-葡萄糖苷酶(α-glycosidase)為淀粉水解酶類中的一種，它可從多糖的非還原末端水解底物的α-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生α-D-葡萄糖，該酶還具備轉(zhuǎn)糖苷酶活性，能夠以麥芽糖等糖基供體，催化糖基化反應(yīng)，修飾多種含羥基的受體化合物。目前，α-葡萄糖苷酶已廣泛應(yīng)用于包括淀粉水解、酒精發(fā)酵和化學(xué)合成等技術(shù)領(lǐng)域。但是目前開(kāi)發(fā)出的工業(yè)應(yīng)用類α-葡萄糖苷酶，尤其是具備較高的轉(zhuǎn)糖苷活性的酶類，還十分有限，人們迫切的需要開(kāi)發(fā)出更多，具備工業(yè)所需酶學(xué)性質(zhì)的α-葡萄糖苷酶新酶。

維生素C（縮寫為VC）又名L-抗壞血酸，具有抑制黑色素合成，促進(jìn)膠原蛋白合成以及抗氧化等多種生理功能，人體不能自身合成，只能靠食物或藥物提供。但是VC本身穩(wěn)定性很差，其在水溶液中極不穩(wěn)定；易被空氣中的氧和其他氧化劑氧化；暴露于中性pH、熱、光和重金屬下會(huì)快速降解等,從而限制了它在某些領(lǐng)域中的應(yīng)用。

L-抗壞血酸葡萄糖苷（AA-2G）是維生素C的一種衍生物，是公認(rèn)的最為穩(wěn)定的VC衍生物，VC分子上2位C上的羥基被吡喃型葡萄糖苷取代，經(jīng)過(guò)皮膚上α-葡萄糖苷酶的作用，L-抗壞血酸葡萄糖苷所含的VC可慢慢被水解出來(lái)，逐漸發(fā)揮VC的生理活性功能，水解后的VC與天然VC有完全相同的結(jié)構(gòu)和生理活性。

利用糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性轉(zhuǎn)糖基作用進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成是目前維生素C葡萄糖苷的唯一生產(chǎn)途徑。目前所報(bào)道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3 .2 .1.20，α-Glucosidase）、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（EC 2 .4 .1 .19，CyclomaltodextrinGlucanotransferase，簡(jiǎn)稱CGTase）、α-淀粉酶（EC 3 .2 .1 .1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2 .4 .1 .7，Sucrose phosphorylas）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2 .4 .1 .5，Dextransucrase）、α-異麥芽糖基葡糖基形成酶等六類酶。

CGTas是目前最常用于合成AA-2G的酶，該酶能夠以的α-環(huán)糊精為底物合成AA-2G。但與麥芽糖、可溶性淀粉等來(lái)源廣泛的底物相比，α-環(huán)糊精的價(jià)格相對(duì)較高。有研究者利用可溶性淀粉和麥芽糊精等較為廉價(jià)的底物，通過(guò)CGTase合成AA-2G，但產(chǎn)量較低，普遍在2－3 g/L左右。并且，用CGTase催化首先得到的是AA系列衍生物，還需要經(jīng)酶解等后處理過(guò)程才能獲得AA-2G。1990年，NorioMuto等首次發(fā)現(xiàn)大米來(lái)源的α-糖苷酶能夠以成本較低的麥芽糖為糖基供體，特異性催化L-AA合成AA-2G。但相關(guān)研究較少。

利用α-糖苷酶催化合成AA-2G具有反應(yīng)簡(jiǎn)單，底物價(jià)廉易得，且產(chǎn)物單一易于分離純化的特點(diǎn)。本專利旨在發(fā)掘新的生物催化劑α-糖苷酶，且用于催化合成AA-2G，為AA-2G生產(chǎn)工藝的多樣性及可能性奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種新的來(lái)源于枸杞的α-葡萄糖苷酶，所述α-葡萄糖苷酶包含SEQNo.1所示的氨基酸序列。

所述來(lái)源于枸杞的α-葡萄糖苷酶能夠?qū)-AA轉(zhuǎn)化為AA-2G。

本發(fā)明提供編碼該酶的多核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ No.2所示。

一種攜帶該多核苷酸的重組載體。

含有該重組載體的重組細(xì)胞。