[發(fā)明專利]基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應用

有效

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• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112266976B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設計）人: 楊歡歡;姜景彬;劉明月;許向陽;李景富;趙婷婷;張賀;孫要光;王鶴璇
• 申請（專利權）人: 東北農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 榮玲

本發(fā)明涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應用，屬于植物分子生物技術領域。為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標記存在帶型不穩(wěn)定，特異性不強的問題，本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記及其擴增引物、包括利用該擴增引物PCR擴增和對擴增產物酶切的檢測方法以及含有該擴增引物的檢測試劑盒。本發(fā)明提供的CAPS分子標記帶型穩(wěn)定、易于區(qū)分、準確率高、特異性強；檢測方法操作簡捷、擴增結果精準度高、成本低，在田間抗病性鑒定中具有較高的穩(wěn)定性，基因型和田間表型吻合率高達90.19％，能夠應用于選育番茄灰葉斑病抗性種質資源。

技術領域

本發(fā)明屬于植物分子生物技術領域，尤其涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應用。

背景技術

番茄是在世界范圍內廣泛種植的重要蔬菜之一，其在生長過程中常常會受到病蟲的危害。番茄灰葉斑病(Tomato gray leaf spot)是近年來流行的一種病害，該病病原為匍柄霉(Stemphylium)真菌，為半知菌亞門絲孢綱成員，可引起多種蔬菜病害。番茄灰葉斑病在世界范圍內均有發(fā)生，溫暖潮濕地區(qū)尤為嚴重。番茄灰葉斑病爆發(fā)嚴重，可導致番茄減產20％～80％，影響番茄的產量和質量。

目前，已被發(fā)現(xiàn)并可利用的番茄灰葉斑病抗性基因只有Sm基因，為單基因不完全顯性遺傳。該基因雖已被轉育到栽培品種中，但至今其抗性仍未被克服。近年來，前人利用一些抗病材料對番茄灰葉斑病的抗性遺傳規(guī)律及分子標記也進行了初步探究。例如RFLP標記CT55、C2_At4g10050和C2_At2g14260均與Sm基因連鎖較為緊密。JI等利用RFLP標記CT55，經(jīng)限制內切酶酶切，開發(fā)出一個隱性CAPS標記，只可區(qū)分抗病純合。隨后，高建昌等建立的與抗性基因Sm連鎖的IndeI標記能區(qū)分抗病純合體與抗病雜合體，但抗病條帶與感病條帶相距很近，不易區(qū)分。而高存等建立的T050標記與抗性基因Sm緊密連鎖，但是這些標記與抗性基因Sm仍存在一定的遺傳距離。同樣，金鳳媚等人利用HPM方法開發(fā)出的無需酶切檢測灰葉斑病抗性基因的標記雖可在一定程度上區(qū)分不同番茄抗、感材料，但是田間鑒定吻合率不高。

發(fā)明內容

為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標記存在帶型不穩(wěn)定，特異性不強的問題，本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應用。

本發(fā)明的技術方案：

一種基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

如本發(fā)明所述基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記的擴增引物，所述擴增引物的核苷酸序列為：

正向引物序列：5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’

反向引物序列：5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’。

一種番茄灰葉斑病抗性基因Sm的檢測方法，包括如下步驟：

步驟一、以待測番茄材料的基因組DNA為模板，利用基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標記的擴增引物進行PCR擴增，所述擴增引物的核苷酸序列為：

正向引物序列：5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’、

反向引物序列：5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’；

步驟二、經(jīng)PCR擴增得到如SEQ ID No.1所示CAPS分子標記的植株為攜帶抗性基因Sm的植株，其所得擴增產物經(jīng)限制性內切酶TaqⅠ酶切，當酶切獲得長度分別為589bp和208bp的兩條特異性譜帶時，待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性純合基因型；當酶切獲得長度分別為589bp、208bp和797bp的三條特異性譜帶時，待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性雜合基因型；