[發(fā)明專利]基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011378178.1 | 申請日: | 2020-11-30 |
| 公開(公告)號: | CN112266976B | 公開(公告)日: | 2022-01-28 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 楊歡歡;姜景彬;劉明月;許向陽;李景富;趙婷婷;張賀;孫要光;王鶴璇 | 申請(專利權(quán))人: | 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號: | C12Q1/6895 | 分類號: | C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司: | 哈爾濱市偉晨專利代理事務(wù)所(普通合伙) 23209 | 代理人: | 榮玲 |
| 地址: | 150030 黑龍*** | 國省代碼: | 黑龍江;23 |
| 權(quán)利要求書: | 查看更多 | 說明書: | 查看更多 |
| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 基于 番茄 葉斑病 抗性 基因 sm caps 分子 標(biāo)記 引物 檢測 方法 試劑盒 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用,屬于植物分子生物技術(shù)領(lǐng)域。為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記存在帶型不穩(wěn)定,特異性不強(qiáng)的問題,本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記及其擴(kuò)增引物、包括利用該擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增和對擴(kuò)增產(chǎn)物酶切的檢測方法以及含有該擴(kuò)增引物的檢測試劑盒。本發(fā)明提供的CAPS分子標(biāo)記帶型穩(wěn)定、易于區(qū)分、準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng);檢測方法操作簡捷、擴(kuò)增結(jié)果精準(zhǔn)度高、成本低,在田間抗病性鑒定中具有較高的穩(wěn)定性,基因型和田間表型吻合率高達(dá)90.19%,能夠應(yīng)用于選育番茄灰葉斑病抗性種質(zhì)資源。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用。
背景技術(shù)
番茄是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜之一,其在生長過程中常常會(huì)受到病蟲的危害。番茄灰葉斑病(Tomato gray leaf spot)是近年來流行的一種病害,該病病原為匍柄霉(Stemphylium)真菌,為半知菌亞門絲孢綱成員,可引起多種蔬菜病害。番茄灰葉斑病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生,溫暖潮濕地區(qū)尤為嚴(yán)重。番茄灰葉斑病爆發(fā)嚴(yán)重,可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20%~80%,影響番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。
目前,已被發(fā)現(xiàn)并可利用的番茄灰葉斑病抗性基因只有Sm基因,為單基因不完全顯性遺傳。該基因雖已被轉(zhuǎn)育到栽培品種中,但至今其抗性仍未被克服。近年來,前人利用一些抗病材料對番茄灰葉斑病的抗性遺傳規(guī)律及分子標(biāo)記也進(jìn)行了初步探究。例如RFLP標(biāo)記CT55、C2_At4g10050和C2_At2g14260均與Sm基因連鎖較為緊密。JI等利用RFLP標(biāo)記CT55,經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切,開發(fā)出一個(gè)隱性CAPS標(biāo)記,只可區(qū)分抗病純合。隨后,高建昌等建立的與抗性基因Sm連鎖的IndeI標(biāo)記能區(qū)分抗病純合體與抗病雜合體,但抗病條帶與感病條帶相距很近,不易區(qū)分。而高存等建立的T050標(biāo)記與抗性基因Sm緊密連鎖,但是這些標(biāo)記與抗性基因Sm仍存在一定的遺傳距離。同樣,金鳳媚等人利用HPM方法開發(fā)出的無需酶切檢測灰葉斑病抗性基因的標(biāo)記雖可在一定程度上區(qū)分不同番茄抗、感材料,但是田間鑒定吻合率不高。
發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記存在帶型不穩(wěn)定,特異性不強(qiáng)的問題,本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記,其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
如本發(fā)明所述基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物,所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
正向引物序列:5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’
反向引物序列:5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’。
一種番茄灰葉斑病抗性基因Sm的檢測方法,包括如下步驟:
步驟一、以待測番茄材料的基因組DNA為模板,利用基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列為:
正向引物序列:5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’、
反向引物序列:5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’;
步驟二、經(jīng)PCR擴(kuò)增得到如SEQ ID No.1所示CAPS分子標(biāo)記的植株為攜帶抗性基因Sm的植株,其所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ酶切,當(dāng)酶切獲得長度分別為589bp和208bp的兩條特異性譜帶時(shí),待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性純合基因型;當(dāng)酶切獲得長度分別為589bp、208bp和797bp的三條特異性譜帶時(shí),待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性雜合基因型;
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