[發(fā)明專利]基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011378178.1
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112266976B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊歡歡;姜景彬;劉明月;許向陽;李景富;趙婷婷;張賀;孫要光;王鶴璇
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務(wù)所(普通合伙) 23209
• 代理人: 榮玲

本發(fā)明涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用，屬于植物分子生物技術(shù)領(lǐng)域。為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記存在帶型不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng)的問題，本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記及其擴(kuò)增引物、包括利用該擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增和對擴(kuò)增產(chǎn)物酶切的檢測方法以及含有該擴(kuò)增引物的檢測試劑盒。本發(fā)明提供的CAPS分子標(biāo)記帶型穩(wěn)定、易于區(qū)分、準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)；檢測方法操作簡捷、擴(kuò)增結(jié)果精準(zhǔn)度高、成本低，在田間抗病性鑒定中具有較高的穩(wěn)定性，基因型和田間表型吻合率高達(dá)90.19％，能夠應(yīng)用于選育番茄灰葉斑病抗性種質(zhì)資源。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物分子生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要蔬菜之一，其在生長過程中常常會(huì)受到病蟲的危害。番茄灰葉斑病(Tomato gray leaf spot)是近年來流行的一種病害，該病病原為匍柄霉(Stemphylium)真菌，為半知菌亞門絲孢綱成員，可引起多種蔬菜病害。番茄灰葉斑病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，溫暖潮濕地區(qū)尤為嚴(yán)重。番茄灰葉斑病爆發(fā)嚴(yán)重，可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20％～80％，影響番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。

目前，已被發(fā)現(xiàn)并可利用的番茄灰葉斑病抗性基因只有Sm基因，為單基因不完全顯性遺傳。該基因雖已被轉(zhuǎn)育到栽培品種中，但至今其抗性仍未被克服。近年來，前人利用一些抗病材料對番茄灰葉斑病的抗性遺傳規(guī)律及分子標(biāo)記也進(jìn)行了初步探究。例如RFLP標(biāo)記CT55、C2_At4g10050和C2_At2g14260均與Sm基因連鎖較為緊密。JI等利用RFLP標(biāo)記CT55，經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切，開發(fā)出一個(gè)隱性CAPS標(biāo)記，只可區(qū)分抗病純合。隨后，高建昌等建立的與抗性基因Sm連鎖的IndeI標(biāo)記能區(qū)分抗病純合體與抗病雜合體，但抗病條帶與感病條帶相距很近，不易區(qū)分。而高存等建立的T050標(biāo)記與抗性基因Sm緊密連鎖，但是這些標(biāo)記與抗性基因Sm仍存在一定的遺傳距離。同樣，金鳳媚等人利用HPM方法開發(fā)出的無需酶切檢測灰葉斑病抗性基因的標(biāo)記雖可在一定程度上區(qū)分不同番茄抗、感材料，但是田間鑒定吻合率不高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有番茄灰葉斑病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記存在帶型不穩(wěn)定，特異性不強(qiáng)的問題，本發(fā)明提供了基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記、引物、檢測方法、檢測試劑盒與應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

如本發(fā)明所述基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列為：

正向引物序列：5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’

反向引物序列：5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’。

一種番茄灰葉斑病抗性基因Sm的檢測方法，包括如下步驟：

步驟一、以待測番茄材料的基因組DNA為模板，利用基于番茄灰葉斑病抗性基因Sm的CAPS分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物的核苷酸序列為：

正向引物序列：5’-GTCCGAGCAACATAGCTCCC-3’、

反向引物序列：5’-ATGGACCAACCTTGCAAACG-3’；

步驟二、經(jīng)PCR擴(kuò)增得到如SEQ ID No.1所示CAPS分子標(biāo)記的植株為攜帶抗性基因Sm的植株，其所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqⅠ酶切，當(dāng)酶切獲得長度分別為589bp和208bp的兩條特異性譜帶時(shí)，待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性純合基因型；當(dāng)酶切獲得長度分別為589bp、208bp和797bp的三條特異性譜帶時(shí)，待測番茄材料攜帶番茄灰葉斑病抗性基因Sm且為陽性雜合基因型；