[發(fā)明專利]一種檢測(cè)大鼠外周血HDAC5表達(dá)水平的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011376896.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN112342281A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李文強(qiáng);蘇璽;宋盟;邵明龍;劉青;張露文;呂路線
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省精神病醫(yī)院（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測(cè)大鼠外周血HDAC5表達(dá)水平的試劑盒，其特征在于：該試劑盒所包含的試劑及使用說明如下表所示：

表中：引物Ⅰ：GTCGAAAGGATGGCACTGTT(HDAC5上游)

引物Ⅱ：AGCCAGTAAAGCCGTTCTCA(HDAC5下游)

引物Ⅲ：GGAGCGAGATCCCGTCAAGA(GAPDH上游)

引物Ⅳ：CACAAACATGGGGGCATCAG(GAPDH下游)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下操作流程：

第一步：外周血單核細(xì)胞的分離

取肝素抗凝血5mL，沿管壁徐徐滴流疊加在盛有5mL溶液a的試管內(nèi)，應(yīng)注意保持兩者界面清晰，在室溫下以2000r/min的速度離心20min，用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單核細(xì)胞；

第二步：?jiǎn)魏思?xì)胞RNA的抽提

步驟(1)：收集到的單核細(xì)胞加入1000μL的溶液b，室溫放置5min；

步驟(2)：加入200μL的溶液c，渦旋混勻15sec；

步驟(3)：室溫放置10min后，在4℃的環(huán)境下，12000g離心15min；

步驟(4)：取上清，加入等體積的溶液d，顛倒混勻10余次；

步驟(5)：室溫靜置10min，在4℃的環(huán)境下，在4℃的環(huán)境下，12000g離心15min；

步驟(6)：棄上清，加入1mL 75％溶液e(溶液e使用溶液f稀釋配置)，洗滌沉淀RNA；

步驟(7)：4℃，7500g離心5min，重復(fù)步驟(6)-步驟(7)；

步驟(8)：棄上清，于超凈工作臺(tái)中干燥5min；

步驟(9)：加入適量溶液f(20～50μL)溶解RNA，置于55℃水浴10min，轉(zhuǎn)彈管壁，離心；

步驟(10)：用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，確保OD260/280比值在1.8-2.0之間；

步驟(11)：根據(jù)測(cè)定濃度稀釋，用溶液f稀釋2μg RNA至20μL體系即為上樣模板；

第三步：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HDAC5與內(nèi)參基因GAPDH

步驟(1)：制備反應(yīng)體系

采用20μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證結(jié)果的可靠性。(HDAC5檢測(cè)加入引物引物Ⅰ和引物Ⅱ；GAPDH內(nèi)參檢測(cè)加入引物Ⅲ和引物Ⅳ)

組分	每孔加入量
溶液g	10μL
正向引物(10μM)	0.5μL
反向引物(10μM)	0.5μL
溶液h	0.2μL
溶液f	6.8μL
RNA模板	2μL
總體積	20μL

操作時(shí)，保證所有試劑都在冰上操作，按照上述反應(yīng)體系用移液槍將PCR反應(yīng)液加入到PCR管中，封蓋后，瞬時(shí)離心，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；

步驟(2)：PCR擴(kuò)增

程序設(shè)定如下(步驟3至步驟5持續(xù)40個(gè)循環(huán))：

步驟(3)：數(shù)據(jù)分析

測(cè)得樣品HDAC5與內(nèi)參基因GAPDH擴(kuò)增的CT值，并采用2-ΔΔCT法，計(jì)算HDAC5的相對(duì)含量。