[發明專利]一種構建MLH1基因敲除細胞系的方法

在審

• 申請號: 202011375917.1
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112501170A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 李軍;程揚;項陽;趙家順
• 申請（專利權）人: 武漢愛博泰克生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 湖北天領艾匹律師事務所 42252
• 代理人: 楊建軍

本發明涉及一種構建MLH1基因敲除細胞系的方法，涉及基因工程技術領域。所述方法是采用CRISPR/Cas9系統來制備MLH1基因敲除細胞系，首先針對MLH1基因設計兩個sgRNA序列，利用分子克隆技術構建重組質粒；然后將重組質粒轉染至HeLa細胞，通過PCR驗證sgRNA的活性后，進行嘌呤霉素藥物篩選和單克隆化處理，然后提取單克隆細胞株基因組DNA以及總蛋白，進行MLH1基因水平測序鑒定以及蛋白水平表達檢測，獲得MLH1基因敲除HeLa細胞系。本發明構建的MLH1基因敲除HeLa細胞系是一種基因穩定遺傳的細胞系。本發明提供的方法可用于MLH1基因的定向敲除致使其功能失活，具有簡便、高效、快速、低成本等特點，對于MLH1基因功能和相關通路的研究具有重要意義。

【技術領域】

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種構建MLH1基因敲除細胞系的方法。

【背景技術】

DNA錯配修復基因(DNA mismatch repair gene，MMR)首先在細菌和酵母中發現，后在人類基因組中也發現類似物，研究證實這種基因在人類遺傳性非息肉型結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和散發性結直腸癌(SporadicCol orectal Cancer,SCRC)的發病過程中起重要作用。DNA錯配修復基因既非癌基因，也非抑癌基因，是另一類腫瘤相關基因，這是繼癌基因與抑癌基因之后，在腫瘤相關分子機制方面的又一重大發現。

hMLH1是MMR家族中的一員，該基因定位于3p21，是細菌錯配修復基因mutL的同源物，與大約30％的HNPCC有關，hMLH1的cDNA全長2484bp，編碼長度為2268bp的開放閱讀框架，hMLH1蛋白由756個氨基酸殘基組成，與酵母錯配修復基因hMLH1有41％的同源性。hMLH1在結直腸癌中可能起著一種看家基因的作用，在部分HNPCC患者中hMLH1基因在第41位密碼子有一個C-T突變，使相應的氨基酸殘基由絲氨酸變成苯丙氨酸。另外，在HNPCC的患者中還檢測到了第578至632位密碼子之間的雜合性缺失及從第727位密碼子的第一個核苷酸開始的4個核苷酸的缺失，在另外一些病例的第519位密碼子則存在一個T的插入，造成hMLH1蛋白產物的羧基端238個氨基酸殘基的缺失。另外，有學者在結直腸癌患者的體細胞中發現了位于hMLH1基因第1151位堿基T-A的雜合型顛換，導致其第384位編碼氨基酸由纈氨酸(Val)突變為天冬氨酸(Asp)。

1993年Ionow和Aaltonen等發現，在幾乎所有的HNPCC腫瘤和約12％～15％的散發性CRC中存在著微衛星上的突變，稱作微衛星不穩定性(microsatellit einstability,MSI)，由此提出了另一條嶄新的途徑—錯配修復途徑。它的基本原理是MMR基因保證了DNA復制的高度保真，一旦MMR基因發生突變或啟動子甲基化引起錯配修復基因失活，導致機體錯配修復功能的降低，進而導致整個基因組的不穩定，MMR功能缺陷的表現型是高度的微衛星不穩定(MSIH)，又稱之為復制錯誤(repliationerror,RER)陽性，從而使某些癌基因和抑癌基因的突變在體內得到快速聚集，腫瘤由此發生，表現為腫瘤細胞的DNA多為二倍體或近二倍體的含量，在此途徑中，hMLH1和hMSH2這兩個MMR基因起主要作用。

也有學者利用Western Blot印跡法檢測了前列腺癌細胞株中錯配修復基因蛋白的丟失情況，同時用免疫組織化學法檢測前列腺癌標本中錯配修復蛋白的表達，以探討錯配修復基因(MMR)蛋白MLH1在前列腺癌細胞株及前列腺癌標本的表達，結果在所研究的8個前列腺癌細胞株中均發現有錯配修復基因hMLH1的缺失；前列腺癌標本中也存在錯配修復蛋白MLH1表達的減多或消失，結果說明了前列腺癌的發生中存在錯配修復基因hMLH1的缺失，即錯配修復基因的缺失直接參與了前列腺癌的發生與發展。