[發明專利]一種構建MLH1基因敲除細胞系的方法

在審

• 申請號: 202011375917.1
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112501170A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 李軍;程揚;項陽;趙家順
• 申請（專利權）人: 武漢愛博泰克生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 湖北天領艾匹律師事務所 42252
• 代理人: 楊建軍

1.一種敲除MLH1基因的sgRNA，包括如SEQ ID NO：1所示的sgRNA1以及如SEQ ID NO：2所示的sgRNA2。

2.如權利要求1所述的sgRNA的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs。

3.如權利要求2所述的sgRNA的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs的構建方法，包括如下步驟：

S1.基于所述sgRNA1和所述sgRNA2，合成帶酶切位點的sgRNA DNA序列及其互補序列，分別退火處理獲得MLH1-sgRNA1和MLH1-sgRNA2兩個雙鏈DNA片段；

S2.分別酶切回收PX459M、EZ-GuideXH兩個載體；

S3.兩個雙鏈DNA片段分別與酶切回收的PX459M、EZ-GuideXH載體連接，并進行產物轉化和測序鑒定，獲得PX459M-MLH1-sgRNA1和EZ-GuideXH-MLH1-sgRNA2；

S4.對PX459M-MLH1-sgRNA1和EZ-GuideXH-MLH1-sgRNA2進行酶切，前者回收含MLH1-sgRNA1的載體骨架，后者回收含MLH1-sgRNA2的DNA片段，然后進行產物連接構建重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs。

4.如權利要求3所述的sgRNA1、sgRNA2的重組質粒的構建方法，其特征在于，所述步驟S1中：所述sgRNA1帶酶切位點的sgRNADNA序列為SEQ ID NO：3，互補序列為SEQ ID NO：4；所述sgRNA2帶酶切位點的sgRNADNA序列為SEQ ID NO：5，互補序列為SEQ ID NO：6。

5.如權利要求3所述的sgRNA1、sgRNA2的重組質粒的構建方法，其特征在于，所述步驟S3中產物轉化和鑒定方法為：將酶切的載體骨架與雙鏈DNA片段的連接產物加入到感受態細菌中，補加培養基培養半小時后涂布于抗性平板，再過夜培養后，挑取單菌落進行擴大培養，收獲菌液抽提重組質粒，然后進行測序鑒定，保存鑒定正確的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNA1和EZ-Guide XH-MLH1-sgRNA2。

6.如權利要求3所述的sgRNA的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs的構建方法，其特征在于，所述步驟S4為：對PX459M-MLH1-sgRNA1回收含MLH1-sgRNA1的載體骨架，對EZ-GuideXH-MLH1-sgRNA2回收含MLH1-sgRNA2的DNA片段，使用DNA連接酶連接回收后的酶切產物；然后同步驟S3進行連接產物的轉化以及鑒定，將測序鑒定正確的重組質粒命名為PX459M-MLH1-sgRNAs。

7.權利要求2所述的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs在制備MLH1基因敲除HeLa細胞系中的應用。

8.權利要求2所述的重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs構建MLH1基因敲除HeLa細胞系的方法，其特征在于，包括如下步驟：

T1.用重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs對HeLa細胞進行轉染；

T2.提取轉染后的細胞基因組，針對MLH1基因進行PCR擴增鑒定，檢測sgRNA的活性；

T3.對轉染后的細胞進行嘌呤霉素藥物篩選處理，然后進行細胞單克隆化處理；

T4.提取單克隆細胞株基因組DNA，進行MLH1基因測序鑒定，獲得MLH1基因敲除HeLa細胞系。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟T2中sgRNA的活性檢測方法為：重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs轉染HeLa細胞后，采用鼠尾基因組DNA檢測試劑盒提取細胞的基因組DNA作為模板，用如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過觀察和比較對照組和實驗組的DNA片段大小，判定sgRNA的活性。

10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟T3中藥篩處理方法為，在所述重組質粒PX459M-MLH1-sgRNAs轉染HeLa細胞后，添加含有嘌呤霉素的完全培養基培養細胞。